タンパク質中の孤立性官能基の化学的性質を決定するための競合ラベリング方法

タンパク質内の官能基の特性は、タンパク質の構造の構築物として組み込まれています。タンパク質中の孤立性官能基のイオン化定数と化学反応性を決定できる一般的な手順を開発しました。この方法は、ヒスチジン、チロシン、リジン、およびシステインの側鎖、およびタンパク質のアミノ末端に適用することができます。この方法は、[3H] - および[14C] 1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン（N2PH-F）を使用した競合ラベリング技術の拡張であり、迅速かつ敏感です。ジニトロフェニルタンパク質の酸加水分解後、タンパク質のユニークな位置に由来する必要がある誘導体が得られるという事実が得られます。この方法は、リゾチーム、アルファライティックプロテアーゼ、およびストレプトマイセス緑のトリプシンの孤独なヒスチジン残基、および後者のタンパク質のアミノ末端に適用されています。0.1 N KClの20度CでのN2PH-Fとの反応のために、次のパラメーターが得られました。HEN卵白リゾチームのヒスチジン、6.4のPKAおよび0.188 m-1 min-1の2次速度定数。アルファライティックプロテアーゼのヒスチジン、6.5のPKAおよび0.0235 m-1 min-1の2次速度定数。S.G.トリプシンのヒスチジン、6.5のPKAおよび0.0328 m-1 min-1の2次速度定数。S.G.トリプシンのバリルアミノ末端、8.1のPKAおよび0.403 M-1の2次速度定数。さらに、得られた結果は、これらの官能基の微小環境に関する手がかりを提供し、研究されたタンパク質が微小環境に影響を与えるpH依存性の立体構造変化を受け、したがってこれらのグループの化学反応性に影響することを示しています。

The properties of the functional groups in a protein can be used as built-in-probes of the structure of the protein. We have developed a general procedure whereby the ionization constant and chemical reactivity of solitary functional groups in proteins may be determined. The method may be applied to the side chain of histidine, tyrosine, lysine, and cysteine, as well as to the amino terminus of the protein. The method, which is an extension of the competitive labeling technique using [3H]- and [14C]1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (N2ph-F) in a double-labeling procedure, is rapid and sensitive. Advantage is taken of the fact that after acid hydrolysis of a dinitrophenylated protein, a derivative is obtained which must be derived from a unique position in the protein. The method has been applied to the solitary histidine residue of lysozyme, alpha-lytic protease, and Streptomyces griseus (S.G.) trypsin, as well as to the amino terminus of the latter protein. The following parameters were obtained for reaction with N2ph-F at 20 degrees C in 0.1 N KCl: the histidine of hen egg-white lysozyme, pKa of 6.4 and second-order velocity constant of 0.188 M-1 min-1; the histidine of alpha-lytic protease, pKa of 6.5 and second-order velocity constant of 0.0235 M-1 min-1; the histidine of S.G. trypsin, pKa of 6.5 and second-order velocity constant of 0.0328 M-1 min-1; the valyl amino terminus of S.G. trypsin, pKa of 8.1 and second-order velocity constant of 0.403 M-1 min-1. In addition, the results obtained provide clues as to the microenvironments of these functional groups, and indicate that the proteins studied undergo pH-dependent conformational changes which affect the microenvironment, and hence the chemical reactivity of these groups.