RhoAによって媒介される形質転換には、ロックキナーゼの活性が必要です

背景：RAS関連のGTPase RhoAは、細胞骨格の再編成、転写調節、および変換に必要なシグナル伝達プロセスを制御します。RHOA変異体が細胞を形質転換する能力は、転写ではなく、細胞骨格の再編成に関与するエフェクターキナーゼであるRock-Iを結合する能力と相関します。転写活性化と形質転換におけるロックキナーゼの役割を調査するために、最近開発された特定の岩阻害剤Y-27632、および岩断層変異体を使用しました。 結果：NIH3T3細胞では、Y-27632は血清応答因子の活性化、C-FOSの転写、または血清刺激後の細胞周期の再突入を妨げませんでした。しかし、Y-27632でNIH3T3細胞を繰り返し処理したが、アクチン繊維ネットワークを大幅に破壊したが、成長率には影響しなかった。Y-27632 RHOAおよびそのグアニンヌクレオチド交換因子DBLおよびMNET1による焦点形成のブロック。DBLとMNET1によって形質転換された細胞の成長速度には影響しませんでしたが、合流時に正常な成長制御を回復し、軟質寒天での成長を妨げました。Y-27632はまた、RASによる焦点形成を有意に阻害しましたが、SRCによる変換の確立または維持に影響はありませんでした。さらに、4つの結腸直腸腫瘍細胞株のうち2つのアンカレッジに依存しない成長を著しく阻害しました。これらのデータと一致して、切り捨てられた岩誘導体は、フォーカス形成アッセイで活性化されたRAFと協力する弱い能力を示しました。 結論：RHOAの構成的活性化による変換の確立と維持の両方に岩のシグナル伝達が必要であり、RAS変換された表現型に貢献します。これらの観察結果は、RASを介した変換におけるRhoの要件の潜在的な説明を提供します。さらに、ロックキナーゼの阻害は治療的使用である可能性があります。

BACKGROUND: The Ras-related GTPase RhoA controls signalling processes required for cytoskeletal reorganisation, transcriptional regulation, and transformation. The ability of RhoA mutants to transform cells correlates not with transcription but with their ability to bind ROCK-I, an effector kinase involved in cytoskeletal reorganisation. We used a recently developed specific ROCK inhibitor, Y-27632, and ROCK truncation mutants to investigate the role of ROCK kinases in transcriptional activation and transformation. RESULTS: In NIH3T3 cells, Y-27632 did not prevent the activation of serum response factor, transcription of c-fos or cell cycle re-entry following serum stimulation. Repeated treatment of NIH3T3 cells with Y-27632, however, substantially disrupted their actin fibre network but did not affect their growth rate. Y-27632 blocked focus formation by RhoA and its guanine-nucleotide exchange factors Dbl and mNET1. It did not affect the growth rate of cells transformed by Dbl and mNET1, but restored normal growth control at confluence and prevented their growth in soft agar. Y-27632 also significantly inhibited focus formation by Ras, but had no effect on the establishment or maintenance of transformation by Src. Furthermore, it significantly inhibited anchorage-independent growth of two out of four colorectal tumour cell lines. Consistent with these data, a truncated ROCK derivative exhibited weak ability to cooperate with activated Raf in focus formation assays. CONCLUSIONS: ROCK signalling is required for both the establishment and maintenance of transformation by constitutive activation of RhoA, and contributes to the Ras-transformed phenotype. These observations provide a potential explanation for the requirement for Rho in Ras-mediated transformation. Moreover, the inhibition of ROCK kinases may be of therapeutic use.