P16（INK4A）の誘導発現は、サイクリン-CDK阻害剤複合体の再ソートにより、CDK4およびCDK2関連キナーゼ活性の両方を阻害します。

P16（INK4A）腫瘍抑制タンパク質の作用様式を調査するために、イソプロピル - ベタ - ジオガラクトピラノシドの添加または除去によりP16（INK4A）の発現が調節できるU2-OS細胞を確立しました。予想どおり、P16（INK4A）の誘導は、サイクリン依存性キナーゼCDK4およびCDK6による網膜芽細胞腫タンパク質（PRB）のリン酸化を阻害することにより、G1細胞周期停止をもたらします。ただし、p16（INK4A）の誘導は、CDK2活性の顕著な阻害も引き起こします。サイクリンE-CDK2の場合、これはサイクリン、CDK、およびCDK阻害剤複合体、特にP27（KIP1）を含む複合体の再配分によってもたらされます。細胞溶解物のサイズ分別は、CDK4のかなりの割合が約200 kDaの活性キナーゼ複合体に関与していることを明らかにしています。p16（ink4a）を誘導すると、この複合体は部分的に解離され、Cdk4の大部分はp16（ink4a）との二項複合体の形成と一致する低分子程度の画分に見られます。P16（INK4A）によるCDK4の隔離により、サイクリンD1はCIP/KIP阻害剤との相互作用に影響を与えることなく、ますますCDK2と関連することができます。したがって、p16（ink4a）の誘導により、p27（kip1）はその忠誠をCDK4からCDK2に切り替えるように見え、コンポーネントのそれに伴う再調整は、サイクリンE-CDK2のp27（KIP1）およびP21（CIP1）の阻害につながります。。重要なことに、P16（INK4A）自体は高次の複合体を形成するようには見えず、圧倒的多数はCDK4およびCDK6とのバイナリ関連を形成するか、自由な関係を形成します。

To investigate the mode of action of the p16(INK4a) tumor suppressor protein, we have established U2-OS cells in which the expression of p16(INK4a) can be regulated by addition or removal of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside. As expected, induction of p16(INK4a) results in a G1 cell cycle arrest by inhibiting phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by the cyclin-dependent kinases CDK4 and CDK6. However, induction of p16(INK4a) also causes marked inhibition of CDK2 activity. In the case of cyclin E-CDK2, this is brought about by reassortment of cyclin, CDK, and CDK-inhibitor complexes, particularly those involving p27(KIP1). Size fractionation of the cellular lysates reveals that a substantial proportion of CDK4 participates in active kinase complexes of around 200 kDa. Upon induction of p16(INK4a), this complex is partly dissociated, and the majority of CDK4 is found in lower-molecular-weight fractions consistent with the formation of a binary complex with p16(INK4a). Sequestration of CDK4 by p16(INK4a) allows cyclin D1 to associate increasingly with CDK2, without affecting its interactions with the CIP/KIP inhibitors. Thus, upon the induction of p16(INK4a), p27(KIP1) appears to switch its allegiance from CDK4 to CDK2, and the accompanying reassortment of components leads to the inhibition of cyclin E-CDK2 by p27(KIP1) and p21(CIP1). Significantly, p16(INK4a) itself does not appear to form higher-order complexes, and the overwhelming majority remains either free or forms binary associations with CDK4 and CDK6.