熱ショックタンパク質70および熱耐性のin vivoシャペロン活動

熱ショックタンパク質70（HSP70）は、おそらくそのシャペロン活性のために、哺乳類細胞の熱耐性に重要な役割を果たすと考えられています。hsp70の過剰発現がテトラサイクリン調節遺伝子発現システムによって一時的に誘導されるクローン細胞株のシャペロン活性と細胞耐熱性を調べました。このシングルセルラインアプローチは、クローンの変動に関連する問題と、Hsp70の構成的過剰発現に起因する間接的な影響を回避します。Hsp70の生体内シャペロン機能は、レポータータンパク質としてホタルルシフェラーゼを使用して定量的に調査されました。シャペロン活性は、Hsp70発現のレベルと厳密に相関することがわかった。さらに、細胞耐熱性のHSP70濃度依存性の増加が観察されました。Hsp70シャペロン活性の寄与を研究するために、テトラサイクリン調節Hsp70を発現する細胞の耐熱性を、同じレベルのHsp70と他のすべての熱ショックタンパク質を発現する熱耐性細胞と比較しました。Hsp70のみの過剰発現は、熱耐性細胞のすべてのHSPの発現と同様に、細胞質ルシフェラーゼ活性の同様の回復を誘導するのに十分でした。しかし、ルシフェラーゼレポータータンパク質が核に向けられた場合、Hsp70のみの発現は、熱耐性細胞で観察される回復レベルを生成するのに十分ではありませんでした。さらに、追加のHSPを含む熱誘発熱耐性細胞で見られる同じレベルのHsp70を発現する細胞は、熱殺害に対する耐性の増加を示しましたが、熱耐性細胞よりも感受性がありました。これらの結果は、Hsp70の誘導性型が細胞質のシャペロン活性を増加させることにより、ストレス耐性状態に寄与することを示唆しています。しかし、その発現だけでは、熱耐性細胞で観察されたレベルに対するクローン耐熱性をもたらすために、他の細胞内区画を保護するには明らかに不十分です。

Heat shock protein 70 (Hsp70) is thought to play a critical role in the thermotolerance of mammalian cells, presumably due to its chaperone activity. We examined the chaperone activity and cellular heat resistance of a clonal cell line in which overexpression of Hsp70 was transiently induced by means of the tetracycline-regulated gene expression system. This single-cell-line approach circumvents problems associated with clonal variation and indirect effects resulting from constitutive overexpression of Hsp70. The in vivo chaperone function of Hsp70 was quantitatively investigated by using firefly luciferase as a reporter protein. Chaperone activity was found to strictly correlate to the level of Hsp70 expression. In addition, we observed an Hsp70 concentration dependent increase in the cellular heat resistance. In order to study the contribution of the Hsp70 chaperone activity, heat resistance of cells that expressed tetracycline-regulated Hsp70 was compared to thermotolerant cells expressing the same level of Hsp70 plus all of the other heat shock proteins. Overexpression of Hsp70 alone was sufficient to induce a similar recovery of cytoplasmic luciferase activity, as does expression of all Hsps in thermotolerant cells. However, when the luciferase reporter protein was directed to the nucleus, expression of Hsp70 alone was not sufficient to yield the level of recovery observed in thermotolerant cells. In addition, cells expressing the same level of Hsp70 found in heat-induced thermotolerant cells containing additional Hsps showed increased resistance to thermal killing but were more sensitive than thermotolerant cells. These results suggest that the inducible form of Hsp70 contributes to the stress-tolerant state by increasing the chaperone activity in the cytoplasm. However, its expression alone is apparently insufficient for protection of other subcellular compartments to yield clonal heat resistance to the level observed in thermotolerant cells.