ピリドキサール5'-リン酸のヘムタンパク質ヒトシストチオニンベータシントーゼへの結合

シスタチオニン ベータ シンターゼ (CBS) は、ピリドキサール 5'-リン酸 (PLP) 依存性酵素であり、セリンとホモシステインの縮合を触媒してシスタチオニンを形成します。哺乳類の CBS はヘムタンパク質であることが最近示されました。CBS におけるヘムの役割は不明ですが、CBS による触媒作用は、反応機構への PLP の関与によってのみ説明できます。この研究では、CBS を水素化ホウ素ナトリウムで処理すると、シッフ塩基が選択的に減少しましたが、ヘムには影響しませんでした。還元酵素のトリプシン消化物からのPLP架橋ペプチドの精製と配列決定により、進化的に保存されたLys119がシッフ塩基を形成する残基であることが明らかになった。セリンとヒドロキシルアミンは、CBS中でPLPとともにそれぞれα-アミノアクリレートとオキシムを形成します。スルフヒドリル含有基質であるホモシステインは、ヘム環境を乱しますが、PLP とは相互作用しません。他の PLP 依存性酵素とは対照的に、CBS は 296 または 330 nm で励起しても PLP 関連の蛍光を発しません。ヒドロキシルアミンの存在下では、PLP は酵素から解離しますが、ヘムは解離しません。PLP の解離は、約 500 秒の短い遅滞期と、それに続く急速な不活化およびより遅い PLP オキシム形成を含む多段階プロセスです。PLPを含まないCBSは二次構造の減少とCBS活性の損失を示しますが、PLPによって部分的にしか回復できません。この研究は、PLP とヘムタンパク質の相互作用に関する最初の包括的な研究を構成します。

Cystathionine beta-synthase (CBS), a pyridoxal 5'-phosphate (PLP) dependent enzyme, catalyzes the condensation of serine and homocysteine to form cystathionine. Mammalian CBS was recently shown to be a heme protein. While the role of heme in CBS is unknown, catalysis by CBS can be explained solely by participation of PLP in the reaction mechanism. In this study, treatment of CBS with sodium borohydride selectively reduced the Schiff base but did not affect the heme. Purification and sequencing of the PLP-cross-linked peptide from a trypsin digest of the reduced enzyme revealed the evolutionarily conserved Lys119 to be the residue forming the Schiff base. Serine and hydroxylamine form an alpha-aminoacrylate and an oxime with PLP in CBS, respectively. The sulfhydryl-containing substrate, homocysteine, disturbs the heme environment but does not interact with PLP. In contrast to other PLP-dependent enzymes, CBS emits no PLP-related fluorescence when excited at 296 or 330 nm. PLP but not heme dissociates from the enzyme in the presence of hydroxylamine. The dissociation of PLP is a multistage process involving a short approximately 500 s lag phase, followed by a rapid inactivation and a slower PLP-oxime formation. PLP-free CBS exhibits a decrease of secondary structure as well as loss of CBS activity that can be only partially restored by PLP. This study constitutes the first comprehensive investigation of PLP interaction with a heme protein.