Pichia Pastorisによるミツバチ臭気結合タンパク質の生産の最適化

ミツバチの一般的な一般的な臭気結合タンパク質ASP2は、メチロトロフィック酵母pichia pichia pichia pichia asp2で発現しています。Saccharomyces cerevisiaeのGlu-ala-glu-alaスペーサーペプチドまたはそのネイティブシグナルペプチドの有無にかかわらず、アルファファクターの前シェアのいずれかを使用して、緩衝液中に分泌されました。ASP2は、スペーサーペプチドとアルファファクターのプレ前シュートを使用して分泌されたのに対し、N末端の不均一性を示しましたが、他の2つの分泌ペプチドを使用した組換えタンパク質は正しく処理されました。質量分析により、天然ペプチド配列を使用して分泌されたタンパク質の質量は13,695.1 Daであり、天然タンパク質の測定された分子量と完全に一致していることが示されました。これらのデータは、ネイティブのような処理と、スルフヒドリル滴定分析によって確認された3つのジスルフィドブリッジ形成を示しました。透析後、組換えタンパク質は、非常に純粋な形のワンステップアニオン交換クロマトグラフィーによって精製されました。7日間の発酵後の最終的な発現収率は、約150 mg/リットルでした。私たちの知る限り、これはP. pastorisでの正しい処理を伴う分泌のための自然な昆虫リーダーのシーケンスの使用に関する最初の報告です。組換えASP2の過剰生産により、リガンド結合および変異解析がタンパク質の構造と生物学的機能の関係を理解できるようにする必要があります。

A honeybee putative general odorant-binding protein ASP2 has been expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. It was secreted into the buffered minimal medium using either the alpha-factor preprosequence with and without the Glu-Ala-Glu-Ala spacer peptide of Saccharomyces cerevisiae or its native signal peptide. Whereas ASP2 secreted using the alpha-factor preprosequence with the spacer peptide showed N-terminal heterogeneity, the recombinant protein using the two other secretion peptides was correctly processed. Mass spectrometry showed that the protein secreted using the natural peptide sequence had a mass of 13,695.1 Da, in perfect agreement with the measured molecular mass of the native protein. These data showed a native-like processing and the three disulfide bridges formation confirmed by sulfhydryl titration analysis. After dialysis, the recombinant protein was purified by one-step anion-exchange chromatography in a highly pure form. The final expression yield after 7-day fermentation was approximately 150 mg/liter. To our knowledge, this is the first report of the use of a natural insect leader sequence for secretion with correct processing in P. pastoris. The overproduction of recombinant ASP2 should allow ligand binding and mutational analysis to understand the relationships between structure and biological function of the protein.