シンセファルストラムracemosumヌクレアーゼのタンパク質構造と遺伝子クローニング

真菌シンクス症のracemosum（Sr-）ヌクレアーゼの完全なアミノ酸配列は、無傷のタンパク質とそのプロテアーゼが消化したペプチドのタンパク質配列決定に基づいて描写されています。結果として得られる250-レシドーシーケンスは、ASN134に炭水化物側鎖と2つの半様式残基（CYS242およびCYS247）が架橋して小さな拡散ループを形成することを示しています。SR-Nucleaseのシーケンスに基づいて、シーケンスデータベースのコンピューター検索により、Cunninghamella echinulata Nuclease C1および酵母ミトコンドリアヌクレアーゼのシーケンスと60％および48％の位置的アイデンティティが得られ、いくつかの既知のママリアンのものとはほとんど類似していません。DNASE I. 3つの類似のヌクレアーゼの配列アラインメントは、単一の小さなディスルフィドループが変化していないことを明らかにしていますが、SR-ヌクレアーゼの炭水化物の付着は他の2つのヌクレアーゼには存在しません。アライメントは、活性部位の必須残基の1つとして割り当てられているSr-Nuclease His85を抱える高度に保存された領域も示しています。SR-ヌクレアーゼをコードするcDNAは、そのアミノ酸配列に基づいて逆転写酵素媒介PCRを使用して増幅されました。その後、特定のプライマーを合成して、cDNA端（人種）の3 'および5'の急速な増幅で使用するために合成されました。レース製品の直接シーケンスにより、SRヌクレアーゼの1.1 kb cDNAシーケンスが控除されました。cDNAには、70レシドの推定シグナルペプチドと250-レシドの成熟タンパク質を含む320アミノ酸残基の開いた読み取りフレームが含まれています。最後に、組換えSR-ヌクレアーゼは、大腸菌株BL21（DE3）で発現しました。そこでは、界面活性剤および再溶解後の組換えタンパク質がDNaseおよびRNase活性の両方を示しました。His85の活性部位への割り当ては、His85がALAに置き換えられた変異タンパク質Sr-Nuclease（H85a）がDNAまたはRNAを分解できなかったという証拠によってさらに支持されました。

The complete amino acid sequence of the fungus Syncephalastrum racemosum (Sr-) nuclease has been delineated on the basis of protein sequencing of the intact protein and its protease-digested peptides. The resulting 250-residue sequence shows a carbohydrate side chain attached at Asn134 and two half-cystine residues (Cys242 and Cys247) cross-linked to form a small disulphide loop. On the basis of the sequence of Sr-nuclease, a computer search in the sequence database yielded 60% and 48% positional identities with the sequences of Cunninghamella echinulata nuclease C1 and yeast mitochondria nuclease respectively, and very little similarity to those of several known mammalian DNases I. Sequence alignment of the three similar nucleases reveals that the single small disulphide loop is unchanged but the carbohydrate attachment in Sr-nuclease is absent from the other two nucleases. Alignment also shows a highly conserved region harbouring Sr-nuclease His85, which is assigned as one of the essential residues in the active site. The cDNA encoding Sr-nuclease was amplified by using reverse transcriptase-mediated PCR with degenerate primers based on its amino acid sequence. Subsequently, specific primers were synthesized for use in the 3' and 5' rapid amplification of cDNA ends (RACE). Direct sequencing of the RACE products led to the deduction of a 1.1 kb cDNA sequence for Sr-nuclease. The cDNA contains an open reading frame of 320 amino acid residues including a 70-residue putative signal peptide and the 250-residue mature protein. Finally, the recombinant Sr-nuclease was expressed in Escherichia coli strain BL21(DE3) in which the recombinant protein, after solubilization with detergent and renaturation, showed both DNase and RNase activities. The assignment of His85 to the active site was further supported by evidence that the mutant protein Sr-nuclease (H85A), in which His85 was replaced by Ala, was not able to degrade DNA or RNA.