フラボシトクロムP450 BM3における主要なアクティブサイト残基の役割

Bacillus Megaterium flavocytochrome P450 BM3における主要な活性部位残基（Arg-47、Tyr-51、Phe-42およびPhe-87）の変異の効果を調査しました。LaurateとArachidonateの酸化に関する速度論的研究では、Arg-47の側鎖がTyr-51（Lourateの酸化のための運動パラメーター：R47Aミュータント、KM 859マイクロム、Tyr-51の副酸カルボキシル酸の安定化により大きく寄与することが示されました。KCAT 3960 min-1; y51f変異体、km 432 microM、kcat 6140 min-1;野生型、km 288 microM、kcat 5140 min-1）。LaurateのY51F触媒酸化のKCATがわずかに増加したのは、おそらく基質結合の小さなデルタグに起因する活性化エネルギー（DelTAG）の減少によるものです。PHE-42のサイドチェーンは、基質結合チャネルの口の上でフェニル「キャップ」として機能します。変異体F42Aでは、kmが大幅に増加し、KCATはローレート（km 2. 08 mm、kcat 2450 min-1）とアラキドネート（km 34.9 microM、kcat 14620 min-1; 4.7 microMおよびkcat 14620 min-1の両方の酸化のために減少します。野生型のためにそれぞれ17100 min-1）。アミノ酸PHE-87は、効率的な触媒に重要です。変異体F87GおよびF87Yは、脂肪酸酸化のKMの増加とKCAT値の減少を示すだけでなく、「高速」から「遅い」基質代謝回転速度まで不可逆的な変換プロセスを受けます[F87G（F87Y） - 触媒のあるLAURATE酸化の場合：kcat 'fast'、760（1620）min-1;kcat 'slow'、48.0（44.6）min-1;KCONV（高速から遅い形式への変換速度）、4.9（23.8）min-1]。すべての変異体は、脂肪酸酸化からのNADPH酸化の10％未満の除去を示しました。FMNからHAEMへの電子移動の速度は、分析されたすべての変異体で速度制限になることが示されました。野生型P450 BM3の場合、FMNからHAEMへの電子移動の速度（8340 min-1）は、定常状態の酸化速度（4100 min-1）の2倍であり、他のステップが速度制限に寄与していることを示しています。変異体の活性部位構造は、阻害剤12-（イミダゾリル）ドデカン酸と1-フェニルイミダゾールでプローブされました。変異体F87gは、1-フェニルイミダゾールを> 10倍に>野生型に結合しますが、変異体Y51Fはヘムを順応させる脂肪酸アナログ12-（イミダゾリル）ドデカン酸> 30倍の野生型よりも緊密に結合します。

The effects of mutation of key active-site residues (Arg-47, Tyr-51, Phe-42 and Phe-87) in Bacillus megaterium flavocytochrome P450 BM3 were investigated. Kinetic studies on the oxidation of laurate and arachidonate showed that the side chain of Arg-47 contributes more significantly to stabilization of the fatty acid carboxylate than does that of Tyr-51 (kinetic parameters for oxidation of laurate: R47A mutant, Km 859 microM, kcat 3960 min-1; Y51F mutant, Km 432 microM, kcat 6140 min-1; wild-type, Km 288 microM, kcat 5140 min-1). A slightly increased kcat for the Y51F-catalysed oxidation of laurate is probably due to decreased activation energy (DeltaG) resulting from a smaller DeltaG of substrate binding. The side chain of Phe-42 acts as a phenyl 'cap' over the mouth of the substrate-binding channel. With mutant F42A, Km is massively increased and kcat is decreased for oxidation of both laurate (Km 2. 08 mM, kcat 2450 min-1) and arachidonate (Km 34.9 microM, kcat 14620 min-1; compared with values of 4.7 microM and 17100 min-1 respectively for wild-type). Amino acid Phe-87 is critical for efficient catalysis. Mutants F87G and F87Y not only exhibit increased Km and decreased kcat values for fatty acid oxidation, but also undergo an irreversible conversion process from a 'fast' to a 'slow' rate of substrate turnover [for F87G (F87Y)-catalysed laurate oxidation: kcat 'fast', 760 (1620) min-1; kcat 'slow', 48.0 (44.6) min-1; kconv (rate of conversion from fast to slow form), 4.9 (23.8) min-1]. All mutants showed less than 10% uncoupling of NADPH oxidation from fatty acid oxidation. The rate of FMN-to-haem electron transfer was shown to become rate-limiting in all mutants analysed. For wild-type P450 BM3, the rate of FMN-to-haem electron transfer (8340 min-1) is twice the steady-state rate of oxidation (4100 min-1), indicating that other steps contribute to rate limitation. Active-site structures of the mutants were probed with the inhibitors 12-(imidazolyl)dodecanoic acid and 1-phenylimidazole. Mutant F87G binds 1-phenylimidazole >10-fold more tightly than does the wild-type, whereas mutant Y51F binds the haem-co-ordinating fatty acid analogue 12-(imidazolyl)dodecanoic acid >30-fold more tightly than wild-type.