Streptomyces Arenae DSM 40737およびポリケチド合成酵素遺伝子の異種発現からのナフソシクノン遺伝子クラスターの分離と特性評価

Streptomyces anieは、グラム陽性菌に対する活性を示す芳香族ポリケチドナフソシクノンを生成します。推定ナフソシクノン遺伝子クラスターを含むCOSMIDクローンは、S。coelicolorのアクチノルホジンPKSから保存された領域とのハイブリダイゼーションにより、S。aneraeのゲノムライブラリーから分離されました。Acti Probeでハイブリダイズする5.5 kb DNAフラグメントの配列分析により、最小限のポリケチドシンターゼをコーディングする3つのオープンリーディングフレームが明らかになりました。以前に記載されたいくつかのケトシントロ、鎖長因子、および他のポリケチド遺伝子クラスターからのアシルキャリアタンパク質には、強力な配列の類似性が見つかりました。S. areanaeのPKS遺伝子の下流の追加のオープンリーディングフレームは、おそらくアロマターゼをコードするVII Act VIIに対して53％の同一性を示しました。別のオープンリーディングフレームは、PKS遺伝子の上流1.436 bpの領域で特定されましたが、データベース内の既知の遺伝子とは類似性がありませんでした。PKS遺伝子の約8 kb上流であるDNAフラグメントが、それぞれシクラーゼと推定調節タンパク質をコードするActVII-activ特異的プローブにハイブリダイズすることを確認しました。チオトレプトン抵抗性遺伝子の挿入による提案されたナフソシクノン遺伝子クラスターの破壊は、変異株におけるナフソシクニョンの産生を完全に除外し、実際にナフソシクノン遺伝子クラスターが単離されていたことを示しています。S. coelicolor Ch999の最小PKS遺伝子の異種発現は、ケトルダクターゼACTの存在下で、マトクチンとデヒドロムタクチンの産生をもたらし、S。aneaeポリケチド合成酵素がナフソシクニネ栄養素を構築するように縮小するC-16バックボーンを形成することを示しています。提案されたシクラーゼとアロマターゼの機能は、異なるポリケチドコア生産者の遺伝子との共発現によって調べられました。

Streptomyces arenae produces the aromatic polyketide naphthocyclinone, which exhibits activity against Gram-positive bacteria. A cosmid clone containing the putative naphthocyclinone gene cluster was isolated from a genomic library of S. arenae by hybridization with a conserved region from the actinorhodin PKS of S. coelicolor. Sequence analysis of a 5.5-kb DNA fragment, which hybridizes with the actI probe, revealed three open reading frames coding for the minimal polyketide synthase. A strong sequence similarity was found to several previously described ketosynthases, chain length factors and acyl carrier proteins from other polyketide gene clusters. An additional open reading frame downstream of the PKS genes of S. arenae showed 53% identity to act VII probably encoding an aromatase. Another open reading frame was identified in a region of 1.436 bp upstream of the PKS genes, which, however, had no similarity to known genes in the database. Approximately 8 kb upstream of the PKS genes, a DNA fragment was identified that hybridizes to an actVII--actIV specific probe coding for a cyclase and a putative regulatory protein, respectively. Disruption of the proposed naphthocyclinone gene cluster by insertion of a thiostrepton resistance gene completely abolished production of naphthocyclinones in the mutant strain, showing that indeed the naphthocyclinone gene cluster had been isolated. Heterologous expression of the minimal PKS genes in S. coelicolor CH999 in the presence of the act ketoreductase led to the production of mutactin and dehydromutactin, indicating that the S. arenae polyketide synthase forms a C-16 backbone that is subsequently dimerized to build naphthocyclinone. The functions of the proposed cyclase and aromatase were examined by coexpression with genes from different polyketide core producers.