表皮成長因子受容体のGFP融合タンパク質に適用された接着培養細胞の固定プロトコルの比較

背景：タンパク質の細胞内分布の分析は、シグナル伝達などのプロセスを理解するために不可欠です。ほとんどの場合、複数のコンポーネントの並列解析には、固定と免疫蛍光標識が必要です。したがって、固定手順がin vivoタンパク質分布を保持することを確認する必要があります。緑色蛍光タンパク質（GFP）を備えた融合タンパク質は、この目的のための理想的なツールです。ただし、フルオロフォアの形成または分解の特定の側面、つまりGFP融合タンパク質の検出を妨げる可能性のある反応を考慮する必要があります。 方法：GFPを伴う上皮成長因子受容体（EGFR）の融合タンパク質、および従来の培養細胞では、in vivoでの分布を比較するためのテスト症例として、従来のエピフルオレオスとレーザー走査によるin vivoの分布を比較するためのテスト症例として使用した。顕微鏡。融合タンパク質のGFPシグナルとGFPポリペプチドの分布を比較するために、間接的な免疫蛍光を採用しました。 結果：アンチオフェディング剤モウィオールでのその後のマウントを伴うパラホルムアルデヒド（PFA）固定は、トリスマまたはヘペス緩衝生理食塩水ではなく、血漿膜から血漿核領域へのEGFRの部分的な再分配をもたらしました。再分配は、GFPおよびEGFR免疫蛍光で確認されました。Mowiol搭載細胞の生体内分布は、細胞を複合PFA/メタノール固定手順で処理した場合に保存され、可溶性GFPの蛍光も保持しました。抗GFP抗血清は、N末端融合タンパク質に対して陰性でした。 結論：組み合わせたPFA/メタノールプロトコルは、膜貫通および可溶性細胞質タンパク質の固定に普遍的に適用可能であり、GFPの蛍光を維持します。

BACKGROUND: The analysis of the subcellular distribution of proteins is essential for the understanding of processes such as signal transduction. In most cases, the parallel analysis of multiple components requires fixation and immunofluorescence labeling. Therefore, one has to ascertain that the fixation procedure preserves the in vivo protein distribution. Fusion proteins with the green fluorescent protein (GFP) are ideal tools for this purpose. However, one must consider specific aspects of the fluorophore formation or degradation, i.e. reactions that may interfere with the detection of GFP fusion proteins. METHODS: Fusion proteins of the epidermal growth factor receptor (EGFR) with GFP as well as free, soluble GFP stably or transiently expressed in adherent cultured cells served as test cases for comparing the distribution in vivo with that after fixation by conventional epifluorescence and laser scanning microscopy. Indirect immunofluorescence was employed to compare the distributions of the GFP signal and of the GFP polypeptide in the fusion protein. RESULTS: Paraformaldehyde (PFA) fixation with subsequent mounting in the antifading agent Mowiol, but not in Tris- or HEPES buffered saline, led to a partial redistribution of the EGFR from the plasma membrane to the perinuclear region. The redistribution was confirmed with the GFP and EGFR immunofluorescence. The in vivo distribution in Mowiol mounted cells was preserved if cells were treated with a combined PFA/methanol fixation procedure, which also retained the fluorescence of soluble GFP. The anti-GFP antiserum was negative for the N-terminal fusion protein. CONCLUSIONS: The combined PFA/methanol protocol is universally applicable for the fixation of transmembrane and soluble cytoplasmic proteins and preserves the fluorescence of GFP.