大腸菌の組換えHisタグ付きSSBタンパク質のクローニング、過剰発現、および精製およびポリメラーゼ連鎖反応増幅における使用

大腸菌のSSBタンパク質の完全な構造遺伝子を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）由来のDNAフラグメントを発現ベクターにクローニングしました。Hisタグ付きSSBタンパク質を発現するクローンが選択されました。クローン化されたDNAフラグメントは、いくつかのクローンをシーケンスすることにより、本物であることが確認されました。組換えSSBタンパク質（HISタグ付きSSB）には、N末端（38の追加アミノ酸）にポリヒスチジンタグが含まれており、Ni2+親和性クロマトグラフィーによる単一ステップ分離を可能にしました。組換えプラスミドは不安定であり、大腸菌BL21（DE3）株で低レベルの発現を得ることがわかりました。しかし、プラスミドは、誘導前の発現を抑制するプライスプラスミドを含む大腸菌BL21（DE3）で安定しており、HISタグ付きタンパク質はIPTG添加時に高度に発現しました。SSBタンパク質は、Ni2+ - セファロースカラムの金属親和性クロマトグラフィーによって精製されました。酵素は、一本鎖DNA結合活性の蛍光滴定実験によって特徴付けられました。HISタグ付きSSBタンパク質の使用を適用して、多様なテンプレートで増幅効率を向上させました。SSBタンパク質の使用は、PCR効率の向上に一般的に適用できることが証明される場合があります。

Polymerase chain reaction (PCR)-derived DNA fragment containing the complete structural gene for SSB protein of the Escherichia coli was cloned into an expression vector. The clones expressing His-tagged SSB protein were selected. The cloned DNA fragments were verified to be authentic by sequencing several clones. The recombinant SSB protein (His-tagged SSB) contained a polyhistidine tag at the N-terminus (38 additional amino acids) that allowed single-step isolation by Ni2+ affinity chromatography. We found that recombinant plasmids are unstable and give a low level of expression in E. coli BL21(DE3) strain. However, the plasmids were stable in E. coli BL21(DE3) containing the pLysS plasmid, which suppresses expression prior to induction, and His-tagged proteins were highly expressed upon IPTG addition. The SSB protein was purified by metal-affinity chromatography on Ni2+-TED-Sepharose columns. The enzyme was characterized by fluorescence titration experiments for single-stranded DNA binding activity. We have applied the use of His-tagged SSB protein to increase amplification efficiency with a number of diverse templates. The use of SSB protein may prove to be generally applicable in improving PCR efficiency.