RGPA、RGPB、KGP、およびHAGAの組み合わせによる変異体のポルフィロモナス歯肉菌のタンパク質分解、ヘモグロビン結合、および血球凝集の遺伝分析

ポルフィロモナスジンジバリスは、細胞外および細胞関連の型にアルギニン特異的システインプロテイナーゼ（Arg-Gingipain、RGP）およびリジン特異的システインプロテイナーゼ（Lys-Gingipain、KGP）を産生します。2つの別々の遺伝子（RGPAおよびRGPB）と単一の遺伝子（KGP）がそれぞれRGPとKGPをエンコードすることがわかっています。薬剤耐性遺伝子マーカーによって中断されたクローン化されたRGPおよびKGP DNAとの相同組換えにより、RGPA RGPB KGPトリプル変異体を構築しました。トリプル変異体は、細胞抽出物または培養上清のいずれでもRGPまたはKGP活性を示さなかった。豊富な培地で成長したトリプル変異体の培養上清は、ヒトI型コラーゲンに由来するウシ血清アルブミンまたはゼラチンに対してタンパク質分解活性を持っていませんでした。さらに、変異体は、唯一の炭素/エネルギー源としてウシ血清アルブミンを含む定義された培地では成長しませんでした。これらの結果は、ヒトIコラーゲンに由来するウシ血清アルブミンおよびゼラチンに対するP. gingivalisのタンパク質分解活性は、RGPおよびKGPに起因するように見えることを示しています。P. gingivalisのヘマグルチニン遺伝子Hagaは、RGPAおよびKGPのC末端領域にも位置する血球凝集とヘモグロビン結合の原因となるアドシンドメイン領域を所有しています。この研究で構築されたRGPA KGP hagaトリプル変異体は、馬のペルオキシダーゼ結合ヒトヘモグロビンを使用した固相結合アッセイによって決定されるように、羊の赤血球またはヘモグロビン結合活性を使用してhema凝集を示しませんでした。。歯肉細胞は赤血球を凝集させ、ヘモグロビンを結合し、ヘムの獲得につながります。

Porphyromonas gingivalis produces arginine-specific cysteine proteinase (Arg-gingipain, RGP) and lysine-specific cysteine proteinase (Lys-gingipain, KGP) in the extracellular and cell-associated forms. Two separate genes (rgpA and rgpB) and a single gene (kgp) have been found to encode RGP and KGP, respectively. We constructed rgpA rgpB kgp triple mutants by homologous recombination with cloned rgp and kgp DNA interrupted by drug resistance gene markers. The triple mutants showed no RGP or KGP activity in either cell extracts or culture supernatants. The culture supernatants of the triple mutants grown in a rich medium had no proteolytic activity toward bovine serum albumin or gelatin derived from human type I collagen. Moreover, the mutants did not grow in a defined medium containing bovine serum albumin as the sole carbon/energy source. These results indicate that the proteolytic activity of P. gingivalis toward bovine serum albumin and gelatin derived from human type I collagen appears to be attributable to RGP and KGP. The hemagglutinin gene hagA of P. gingivalis possesses the adhesin domain regions responsible for hemagglutination and hemoglobin binding that are also located in the C-terminal regions of rgpA and kgp. A rgpA kgp hagA triple mutant constructed in this study exhibited no hemagglutination using sheep erythrocytes or hemoglobin binding activity, as determined by a solid-phase binding assay with horseradish peroxidase-conjugated human hemoglobin, indicating that the adhesin domains seem to be particularly important for P. gingivalis cells to agglutinate erythrocytes and bind hemoglobin, leading to heme acquisition.