レポーター酵素ベータ - グルクロニダーゼの表面化学の指示的進化

遺伝子発現研究のレポーターとしての大腸菌酵素ベータ - グルクロニダーゼ（GUS）の使用は、グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドによる組織固定中の活性の喪失により限られています。野生型酵素よりもグルタルアルデヒドとホルムアルデヒドの両方に対して著しく耐性があるGusバリアントの進化を指示しました。8つのアミノ酸変化を伴うバリアントは、3ラウンドの突然変異、DNAシャッフル、スクリーニングの後に分離されました。驚くべきことに、グルタルアルデヒドはアミンを修飾および架橋することが知られていますが、リジン残基は1つだけ変異しました。代わりに、アミノ酸の変化は一般に保存されたリジンの近くで発生し、酵素の表面化学が選択され、通常は阻害された機能が阻害されるグルタルアルデヒド修飾を受け入れるか避けることを意味します。GUSバリアントを使用して、標準的な固定条件下でアフリカアフリカ型胚の細胞系統を追跡できることを示しました。これにより、他の記者と併用すると二重染色が可能になります。

The use of the Escherichia coli enzyme beta-glucuronidase (GUS) as a reporter in gene expression studies is limited due to loss of activity during tissue fixation by glutaraldehyde or formaldehyde. We have directed the evolution of a GUS variant that is significantly more resistant to both glutaraldehyde and formaldehyde than the wild-type enzyme. A variant with eight amino acid changes was isolated after three rounds of mutation, DNA shuffling, and screening. Surprisingly, although glutaraldehyde is known to modify and cross-link free amines, only one lysine residue was mutated. Instead, amino acid changes generally occurred near conserved lysines, implying that the surface chemistry of the enzyme was selected to either accept or avoid glutaraldehyde modifications that would normally have inhibited function. We have shown that the GUS variant can be used to trace cell lineages in Xenopus embryos under standard fixation conditions, allowing double staining when used in conjunction with other reporters.