クロストリジウムbeijerinckii ncimb 8052のスクロース利用を制御する遺伝子はオペロンを構成します

Clostridium beijerinckii Ncimb 8052のスクロースオペロンは、ショ糖特異的酵素IIBC（SCR）タンパク質（SCRR）、転写リポッレッサー（SCRR）、スクロースヒドロラーゼ（SCRR）、およびATP-DESTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTENTの4つの遺伝子を含む4つの遺伝子で構成されています。フルクトキナーゼ（SCRK）。Scrarbkオペロンは、3段階で大腸菌でクローニングされました。初期の分離は、スクロースを利用できるクローンのために大腸菌のC. beijerinckiiゲノムライブラリをスクリーニングすることにより達成されましたが、オペロンの残りの部分は逆PCRによって分離され、標的遺伝子の破壊によって構築されたSCRB変異体からの脇腹領域のプラスミド救助によって分離されました。。基質特異性アッセイにより、ショ糖加水0はベータフルクトラノシダーゼであり、スクロースとラフィノースを加水分解できないが、イヌリンまたはレバンではなく、SCRK遺伝子がATP/Mg2+依存性フルクトキナーゼをコードしたことが確認されました。両方の酵素活性は、C。beijerinckiiのスクロースによって誘導されました。SCRRまたはSCRB遺伝子への標的プラスミド統合によるC. beijerinckiiのSCRオペロンの破壊により、スクロースを利用できない株が得られ、これがこの生物における唯一の誘導性ショ糖異化経路であることを示しています。RNA分析により、SCRオペロンの遺伝子は5 kb mRNA転写産物に同時転写され、転写がスクロースによって誘導されたが、グルコース、フルクトース、マルトース、またはキシロースでは誘導されなかったことが確認されました。プライマー拡張実験により、転写スタート部位は、抑制性コドンの44 bp上流であると特定されました。SCRR遺伝子の破壊は、上流のSCRA遺伝子の構成的転写をもたらし、SCRRがSCRA演算子シーケンスに作用する転写抑制因子をコードすることを示唆しています。したがって、SCRR遺伝子はそれ自体がポリシストリックSCRARBK mRNAの一部として負に自己調節されます

The sucrose operon of Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 comprises four genes, which encode a sucrose-specific enzyme IIBC(Scr) protein of the phosphotransferase system (ScrA), a transcriptional repressor (ScrR), a sucrose hydrolase (ScrB) and an ATP-dependent fructokinase (ScrK). The scrARBK operon was cloned in Escherichia coli in three stages. Initial isolation was achieved by screening a C. beijerinckii genomic library in E. coli for clones able to utilize sucrose, while the remainder of the operon was isolated by inverse PCR and by plasmid rescue of flanking regions from a scrB mutant constructed by targeted gene disruption. Substrate specificity assays confirmed that the sucrose hydrolase was a beta-fructofuranosidase, able to hydrolyse sucrose and raffinose but not inulin or levans, and that the scrK gene encoded an ATP/Mg2+-dependent fructokinase. Both enzyme activities were induced by sucrose in C. beijerinckii. Disruption of the scr operon of C. beijerinckii by targeted plasmid integration into either the scrR or the scrB gene resulted in strains unable to utilize sucrose, indicating that this was the only inducible sucrose catabolic pathway in this organism. RNA analysis confirmed that the genes of the scr operon were co-transcribed on a 5 kb mRNA transcript and that transcription was induced by sucrose, but not by glucose, fructose, maltose or xylose. Primer extension experiments identified the transcriptional start site as lying 44 bp upstream of the scrA ATG start codon, immediately adjacent to the imperfect pelindrome sequence proposed to be a repressor binding site. Disruption of the scrR gene resulted in constitutive transcription of the upstream scrA gene, suggesting that ScrR encodes a transcriptional repressor which acts at the scrA operator sequence. The scrR gene is therefore itself negatively autoregulated as part of the polycistronic scrARBK mRNA