Rho aのホスホイノシチド依存性の活性化には、Rhoa/Rho-Gdi複合体の部分的な開口が含まれます

Rho GTPaseには、2つの変換形式と2つの細胞局在があります。GTP結合の立体構造では、細胞膜に結合し、活性化されます。不活性GDP結合立体構造では、GDP解離阻害剤（GDI）と呼ばれるサイトゾルタンパク質と関連しています。我々は、複合体がホスホイノシチドとインキュベートされていない限り、RhoA/Rho-GDI複合体のRhoA成分にはクロストリジウムBotulinum C3 ADP-リボシルトランスフェラーゼにアクセスできないと報告した。ここでは、ptdins、ptdins4p、ptdins3,4p2、ptdins4,5p2、およびptdinsp3が、c3依存性ADPリボシル化だけでなく、プレニル化RhoA/Rho-GDI複合体のRHOA成分におけるGDP/GTP交換も強化することを示しています。対照的に、非プレニル化RhoA/Rho-GDI複合体では、ADP-リボシル化とGDP/GTP交換のレベルは、遊離RHOAで測定されたレベルと同じ順序であり、ホスホイノシチドによって修飾されていません。どちらの場合も、ホスホイノシチドは部分的に開かれましたが、複合体を完全に解離しませんでした。ホスホイノシチドでプレニル化RhoA/Rho-GDi複合体を処理すると、好中球膜へのGTP依存性移動が証明されました。Ptdins4Pで前処理し、[alpha32p] GTPで標識されたプレニル化Rho/rho-GDi複合体でオーバーレイアッセイを使用して、26〜32 kDaの分子量を持つ3つの膜タンパク質を放射標識しました。ホスホイノシチドの存在下で、プレニル化RhoA/Rho-Gdi複合体が部分的に開くと結論付けられ、RhoAがGDPをGTPと交換できるようにします。開いたGTP-RHOA/RHO-GDI複合体は、特定の膜タンパク質を標的とする能力を獲得します。

Rho GTPases have two interconvertible forms and two cellular localizations. In their GTP-bound conformation, they bind to the cell membrane and are activated. In the inactive GDP-bound conformation, they associate with a cytosolic protein called GDP dissociation inhibitor (GDI). We previously reported that the RhoA component of the RhoA/Rho-GDI complex was not accessible to the Clostridium botulinum C3 ADP-ribosyl transferase, unless the complex had been incubated with phosphoinositides. We show here that PtdIns, PtdIns4P, PtdIns3,4P2, PtdIns4,5P2 and PtdInsP3 enhance not only the C3-dependent ADP-ribosylation, but also the GDP/GTP exchange in the RhoA component of the prenylated RhoA/Rho-GDI complex. In contrast, in the nonprenylated RhoA/Rho-GDI complex, the levels of ADP-ribosylation and GDP/GTP exchange are of the same order as those measured on free RhoA and are not modified by phosphoinositides. In both cases, phosphoinositides partially opened, but did not fully dissociate the complex. Upon treatment of the prenylated RhoA/Rho-GDI complex with phosphoinositides, a GTP-dependent transfer to neutrophil membranes was evidenced. Using an overlay assay with the prenylated RhoA/Rho-GDI complex pretreated with PtdIns4P and labeled with [alpha32P]GTP, three membrane proteins with molecular masses between 26 and 32 kDa were radiolabeled. We conclude that in the presence of phosphoinositides, the prenylated RhoA/Rho-GDI complex partially opens, which allows RhoA to exchange GDP for GTP. The opened GTP-RhoA/Rho-GDI complex acquires the capacity to target specific membrane proteins.