2つの植物O-メチルトランスフェラーゼの基質識別に関与する特定の残基の同定

二次代謝に関与している多数の植物O-メチルトランスフェラーゼのうち、酵素的に特徴付けられたのはごくわずかであり、基質結合部位の構造と、基質特異性とメチル化調節特性を決定するメカニズムに関する情報はほとんどありません。以前に、2つのO-メチルトランスフェラーゼ、S-アデノシル-L-メチオニンの分離を報告しました：（ISO）Eugenol O-メチルトランスフェラーゼ（IEMT）およびS-アデノシル-L-メチオニン：Clarkia Breweriisのカフェ酸O-メチルトランスフェラーゼ（COMT）、カリフォルニアからの年間工場。IEMTとCOMT（それぞれオイゲノール/イソゲノールとカフェ酸/5-ヒドロキシフェルル酸）は、アミノ酸レベルで83％の同一性を共有していますが、それらは異なる基質特異性とメチル化調節特性を持っています。ここでは、7つのアミノ酸がユージノール/イソゲノールとカフェ酸/5-ヒドロキシフェルル酸を区別する上で重要な役割を果たすことを報告します。IEMTのこれらのアミノ酸がCOMTの対応する残基に置き換えられた場合、ハイブリッドタンパク質はカフェ酸/5-ヒドロキシフェルル酸でのみ活性を示しました。逆に、COMTのこれらのアミノ酸が対応するIEMT残基に置き換えられた場合、ハイブリッドタンパク質はエウゲノール/イソゲノールでのみ活性を持っていました。これらの結果は、O-メチルトランスフェラーゼ基質の好みがいくつかのアミノ酸残基によって決定できるという強力な証拠を提供し、異なる基質特異性を持つ新しいOMTは、いくつかのアミノ酸の変異により既存のOMTから進化し始める可能性があるということです。系統解析により、C。breweriIemtが最近COMTから発展したことが確認されています。

Among the large number of plant O-methyltransferases that are involved in secondary metabolism, only a few have been enzymatically characterized, and little information is available on the structure of their substrate binding site and the mechanism which determines their substrate specificity and methylation regiospecificity. We have previously reported the isolation of two O-methyltransferases, S-adenosyl-l-methionine:(iso)eugenol O-methyltransferase (IEMT) and S-adenosyl-l-methionine:caffeic acid O-methyltransferase (COMT) from Clarkia breweri, an annual plant from California. While IEMT and COMT (which methylate eugenol/isoeugenol and caffeic acid/5-hydroxyferulic acid, respectively) share 83% identity at the amino acid level, they have distinct substrate specificity and methylation regiospecificity. We report here that seven amino acids play a critical role in discriminating between eugenol/isoeugenol and caffeic acid/5-hydroxyferulic acid. When these amino acids in IEMT were replaced by the corresponding residues of COMT, the hybrid protein showed activity only with caffeic acid/5-hydroxyferulic acid. Conversely, when these amino acids in COMT were replaced by corresponding IEMT residues, the hybrid protein had activity only with eugenol/isoeugenol. These results provide strong evidence that O-methyltransferase substrate preference could be determined by a few amino acid residues and that new OMTs with different substrate specificity could begin to evolve from an existing OMT by mutation of a few amino acids. Phylogenetic analysis confirms that C. breweri IEMT evolved recently from COMT.