酵母Fab1p脂質キナーゼの哺乳類オーソログであるPikfyveは、インスリンの5-ホスホイノシチド効果を合成します

ホスファチジルイノシトール（PTDINS）ヘッドグループの1つまたは複数の遊離ヒドロキシルは、酵素リン酸化を受け、真核生物細胞調節における重要な機能を備えたホスホイノシチド（PI）を生成します。そのような2つの種、Ptdins 5-pとptdins 3,5-p（2）は、哺乳類細胞で現在同定されていますが、それらの生合成は不明のままです。私たちは、新しい哺乳類PIキナーゼ、p235を分離しましたが、その正確な基質特異性は決定されたままでした（Shisheva、A.、Sbrissa、D.、およびIkonomov、O。（1999）Mol。Cell。Biol。19、623-634）。ここでは、脂肪細胞の本物のP235などのCOS細胞で発現した組換えP235が、PI基質上のPTDINの顕著な特異性を示し、HPLC分析によってPTDIN 5-PおよびPTDIN 3,5-P（2）として同定された2つの生成物を生成することを報告します。合成Ptdins 3-p基質もPtdins 3,5-p（2）に変換されましたが、自然源から分離されたPtdinよりも大幅に低い範囲に変換されました。P235 PI 5-キナーゼの重要な特性には、非イオン性洗剤に対する高感度と、ワートマニンおよびアデノシンに対する相対耐性が含まれます。異種細胞系の欠失変異体を分析することにより、予測される触媒ドメインに加えて、分子の他の領域がp235酵素活性にとって重要であると判断しました。インスリンで急激に刺激された3T3-L1脂肪細胞の溶解物に由来するp235免疫複合体によって生成されるモノホスホイノシチド生成物のHPLC分解能は、静止細胞の対応するp235免疫複合体と本質的に同じPtdins 5-pレベルを明らかにしました。しかし、急性インスリン作用により、ワートマンに敏感なPTDINS 3-Pピークが増加し、ワートマンに敏感なPI 3-キナーゼのもっともらしい動員を示唆しています。結論として、マウスP235（ここで改名されたPikfyve）は、Ptdins 5-PおよびPtdins 3,5-P（2）生成の強力なin vitro活性を示し、Pikfyveが生合成に重要な役割を果たしていることを意味します。

One or more free hydroxyls of the phosphatidylinositol (PtdIns) head group undergo enzymatic phosphorylation, yielding phosphoinositides (PIs) with key functions in eukaryotic cellular regulation. Two such species, PtdIns 5-P and PtdIns 3,5-P(2), have now been identified in mammalian cells, but their biosynthesis remains unclear. We have isolated a novel mammalian PI kinase, p235, whose exact substrate specificity remained to be determined (Shisheva, A., Sbrissa, D., and Ikonomov, O. (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 623-634). Here we report that recombinant p235 expressed in COS cells, like the authentic p235 in adipocytes, displays striking specificity for PtdIns over PI substrates and generates two products identified as PtdIns 5-P and PtdIns 3,5-P(2) by HPLC analyses. Synthetic PtdIns 3-P substrates were also converted to PtdIns 3,5-P(2) but to a substantially lesser extent than PtdIns isolated from natural sources. Important properties of the p235 PI 5-kinase include high sensitivity to nonionic detergents and relative resistance to wortmannin and adenosine. By analyzing deletion mutants in a heterologous cell system, we determined that in addition to the predicted catalytic domain other regions of the molecule are critical for the p235 enzymatic activity. HPLC resolution of monophosphoinositide products, generated by p235 immune complexes derived from lysates of 3T3-L1 adipocytes acutely stimulated with insulin, revealed essentially the same PtdIns 5-P levels as the corresponding p235 immune complexes of resting cells. However, the acute insulin action resulted in an increase of a wortmannin-sensitive PtdIns 3-P peak, suggestive of a plausible recruitment of wortmannin-sensitive PI 3-kinase(s) to p235. In conclusion, mouse p235 (renamed here PIKfyve) displays a strong in vitro activity for PtdIns 5-P and PtdIns 3,5-P(2) generation, implying PIKfyve has a key role in their biosynthesis.