タンパク質生化学で使用するためのスルフヒドリル還元剤トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィンとジチオトレイトールの比較

新しく導入されたスルフヒドリル還元剤Tris（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）は、一般的に使用されるジチオトレイトール（DTT）に魅力的な潜在的に魅力的な代替品です。モーター酵素ミオシンをタンパク質の例として使用して、タンパク質生化学において重要なDTTとTCEPの特性を比較します。還元剤は、ミオシンの酵素活性を均等に保存します。これは、スルフヒドリル酸化に敏感です。外因性プローブで標識する場合、DTTはミオシンへのマレイミドの付着を阻害し、標識前に除去する必要があります。対照的に、ミオシンへのマレイミドの付着は、TCEPの存在下で達成されましたが、還元剤なしよりも効率が低い。驚くべきことに、ミオシンへのヨードアセトアミドの付着は、低（0.1 mm）濃度のいずれかの還元剤の影響をほとんど受けませんでした。ニトロキシドスピンラベルを利用して電子常磁性共鳴（EPR）分光法では、TCEPは非常に有利です。スピンラベルは、DTTの2〜4倍安定しているため、EPRの長年の問題を軽減します。タンパク質精製中、Ni（2+）のタンパク質を汚染するNi（2+）濃度は、TCEPに影響を与えることなくDTTの急速な酸化を引き起こします。タンパク質の長期貯蔵の場合、TCEPはバッファー中のEGTAなどの金属キレートのないDTTよりも大幅に安定していますが、金属キレートが存在する場合はDTTがより安定しています。したがって、TCEPにはDTTよりも利点がありますが、還元剤の選択はアプリケーション固有です。

The newly introduced sulfhydryl reductant tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) is a potentially attractive alternative to commonly used dithiothreitol (DTT). We compare properties of DTT and TCEP important in protein biochemistry, using the motor enzyme myosin as an example protein. The reductants equally preserve myosin's enzymatic activity, which is sensitive to sulfhydryl oxidation. When labeling with extrinsic probes, DTT inhibits maleimide attachment to myosin and must be removed before labeling. In contrast, maleimide attachment to myosin was achieved in the presence of TCEP, although with less efficiency than no reductant. Surprisingly, iodoacetamide attachment to myosin was nearly unaffected by either reductant at low (0.1 mM) concentrations. In electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy utilizing nitroxide spin labels, TCEP is highly advantageous: spin labels are two to four times more stable in TCEP than DTT, thereby alleviating a long-standing problem in EPR. During protein purification, Ni(2+) concentrations contaminating proteins eluted from Ni(2+) affinity columns cause rapid oxidation of DTT without affecting TCEP. For long-term storage of proteins, TCEP is significantly more stable than DTT without metal chelates such as EGTA in the buffer, whereas DTT is more stable if metal chelates are present. Thus TCEP has advantages over DTT, although the choice of reductant is application specific.