ラムダエキソヌクレアーゼとDNA末端の相互作用の特性化

Lambda exonucleaseは、5 "-3"方向に一本鎖DNA（dsDNA）の1つの鎖を生産的に分解します。この酵素が高い加工性を生成するメカニズムを理解するために、反応の最初のステップ、すなわちラムダエキソヌクレアーゼと基質DNAの端との相互作用を分析します。DNAに結合したラムダエキソヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼマッピングは、酵素がDSDNAで約13〜14 bpを保護し、DNA産物の一本鎖尾部にヌクレオティドを保護しないことを示しています。2-アミノプリンを使用した急速な蛍光ベースのアッセイを開発し、DNAの異なる最終構造の定常状態速度定数を測定しました。5 "端の相対K（CAT）は、5"の縮小> blunt >> 5 "オーバーハンで減少します。これらのデータから、これらのデータから、一本鎖5 "オーバーハング端が酵素に非生産的に結合することができることを提案し、5"端の適切なアライメントを支援するために非加水分解鎖が必要です。また、我々は測定しました。定常状態速度項の長さ依存性傍メーターであり、それらは高度な加工性と一致していることがわかります。

Lambda exonuclease processively degrades one strand of double-stranded DNA (dsDNA) in the 5"-3" direction. To understand the mechanism through which this enzyme generates high processivity we are analyzing the first step in the reaction, namely the interaction of lambda exonuclease with the ends of substrate DNA. Endonuclease mapping of lambda exonuclease bound to DNA has shown that the enzyme protects approximately 13-14 bp on dsDNA, and no nucleo-tides on the single-stranded tail of the DNA product. We have developed a rapid fluorescence-based assay using 2-aminopurine and measured the steady-state rate constants for different end-structures of DNA. The relative k(cat)for 5" ends decreases in the order 5" recessed > blunt >> 5" overhang. However, k(cat)/K(m)remains relatively constant for these different structures suggesting they are all used equally efficiently as substrates. From these data we propose that a single-stranded 5" overhang end can bind non-productively to the enzyme and the non-hydrolyzed strand is required to aid in the proper alignment of the 5" end. We have also measured the length-dependence of the steady-state rate para-meters and find that they are consistent with a high degree of processivity.