嫌気性細菌の生存率の指標としてのテトラゾリウム色素の適用

好気性細菌の代謝活性を評価するために、レドックス染料5-シアノ-2,3、 - ジトリルテトラゾリウム塩化物（CTC）の使用は、近年広く適用されています。この研究では、嫌気性細菌の代謝活性を捕捉する際のCTCの有用性を調べました。さらに、CTCの非生物的減少に寄与する要因も調べられました。CTCは、細菌細胞壁タンパク質を標的とするフルオロクロム5-（4,6-ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン（DTAF）と組み合わせて使用​​され、総細菌数の活性画分を定量化しました。発酵的に成長した大腸菌を含む通性嫌気性菌、およびPseudomonas chlorophis、P。fluorescens、P。Stutzeri、およびP. pseudoalcalegenes subsp。硝酸塩還元条件下で成長した擬似アルカルゲンは、成長のすべての段階でCTCを積極的に減少させました。これらの細胞の95％以上が、指数相中に細胞内CTC-フォルマザン結晶を蓄積しました。発酵的に成長したシントロフォス酸栄養生物を含む義務的な嫌気性細菌、電子受容体としてフマレートとともに栽培されたジオバクター硫黄、デスルフヴィリオデスルフウリカンスsubsp。硫酸塩還元条件下で成長したデスルファリカンとD. halophilus、形成、H2およびCO2、およびH2およびCO2で独立して成長したメタノバクテリウム熱栄養菌で成長した形成メタノバクテリウムはすべて、CTCを細胞内CTC-フラガザン結晶に還元しました。検査されたすべての生物の最適なCTC濃度は5 mmでした。嫌気性CTCインキュベーションは、嫌気性に成長した細胞の定量化には必要ありませんでした。調査されたすべての培養物によるCTC-フォーマザン生産は、バイオマスの生産に比例し、栄養素が追加されていない場合でもCTCの減少が観察されました。CTCは、G。metallireducensまたはG. sulfurreducensのいずれかの成長に続いて、電子受容体としてクエン酸鉄酸第等液を含む培養液によって減少しました。アスコルビン酸、システイン塩酸塩、ジチオトライトール、NADH、NADPH、Fe（II）Cl2、チオグリコール酸ナトリウム、硫化ナトリウムの存在下でCTCの非生物的減少が観察されました。これらの結果は、CTCを使用して嫌気性細菌の代謝活性を捉えることができるが、CTCの非生物的減少を避けるために注意する必要があることを示唆しています。

The use of the redox dye 5-cyano-2,3,-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) for evaluating the metabolic activity of aerobic bacteria has gained wide application in recent years. In this study, we examined the utility of CTC in capturing the metabolic activity of anaerobic bacteria. In addition, the factors contributing to abiotic reduction of CTC were also examined. CTC was used in conjunction with the fluorochrome 5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein (DTAF), that targets bacterial cell wall proteins, to quantitate the active fraction of total bacterial numbers. Facultative anaerobic bacteria, including Escherichia coli grown fermentatively, and Pseudomonas chlorophis, P. fluorescens, P. stutzeri, and P. pseudoalcalegenes subsp. pseudoalcalegenes grown under nitrate-reducing conditions, actively reduced CTC during all phases of growth. Greater than 95% of these cells accumulated intracellular CTC-formazan crystals during the exponential phase. Obligate anaerobic bacteria, including Syntrophus aciditrophicus grown fermentatively, Geobacter sulfurreducens grown with fumarate as the electron acceptor, Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans and D. halophilus grown under sulfate-reducing conditions, Methanobacterium formicicum grown on formate, H2 and CO2, and Methanobacterium thermoautotrophicum grown autotrophically on H2 and CO2 all reduced CTC to intracellular CTC-formazan crystals. The optimal CTC concentration for all organisms examined was 5 mM. Anaerobic CTC incubations were not required for quantification of anaerobically grown cells. CTC-formazan production by all cultures examined was proportional to biomass production, and CTC reduction was observed even in the absence of added nutrients. CTC was reduced by culture fluids containing ferric citrate as electron acceptor following growth of either G. metallireducens or G. sulfurreducens. Abiotic reduction of CTC was observed in the presence of ascorbic acid, cysteine hydrochloride, dithiothreitol, NADH, NADPH, Fe(II)Cl2, sodium thioglycolic acid and sodium sulfide. These results suggest that while CTC can be used to capture the metabolic activity of anaerobic bacteria, care must be taken to avoid abiotic reduction of CTC.