RNaseTのDNase活性とDNAクローニングへのそのアプリケーション

RNase Tは、大腸菌に存在する8つの異なる3 ' - > 5'エクソリボヌクレアーゼの1つです。酵素は、二本鎖（DS）ステムの近くで残基を効率的に除去できる唯一のRNaseであるため、tRNA末端の離職や3 'の成熟を含む安定したRNA代謝に重要な役割を果たします。その特異性とメカニズムの研究の過程で、RNase Tには一本鎖特異的DNase活性もあることがわかりました。精製されたRNase Tは、非処理方法で一本鎖（SS）RNAとSSDNAの両方を分解します。ただし、RNAに対する作用とは対照的に、RNase TはssDNAをはるかに厳密に結合し、配列特異性が低いことを示します。RNAと同様に、DNA二次構造はRNase Tによる分解に強く影響します。したがって、一本鎖3'-拡張を伴うDSDNAでのRNase T作用は、鈍器型DNAを効率的に生成します。RNase Tのこの特性は、それが鈍式DNAクローニングの有用な酵素である可能性があることを示唆しました。ここでは、RNase Tが現在使用されているMung Bean Nucleaseよりもはるかに高いクローニング効率を提供することを示しています。

RNase T is one of eight distinct 3'-->5' exoribonucleases present in Escherichia coli. The enzyme plays an important role in stable RNA metabolism, including tRNA end turnover and 3' maturation of most stable RNAs because it is the only RNase that can efficiently remove residues near a double-stranded (ds) stem. In the course of study of its specificity and mechanism, we found that RNase T also has single-strand-specific DNase activity. Purified RNase T degrades both single-stranded (ss)RNA and ssDNA in a non-processive manner. However, in contrast to its action on RNA, RNase T binds ssDNA much more tightly and shows less sequence specificity. As with RNA, DNA secondary structure strongly affects its degradation by RNase T. Thus, RNase T action on a dsDNA with a single-stranded 3'-extension efficiently generates blunt-ended DNA. This property of RNase T suggested that it might be a useful enzyme for blunt-ended DNA cloning. We show here that RNase T provides much higher cloning efficiency than the currently used mung bean nuclease.