組換えヒト免疫不全ウイルスタイプ1由来ベクターシステムの有効性と安全分析

レンチウイルスは、分割細胞と非分化細胞の両方に感染します。この研究では、組換えヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）に由来するパッケージングベクター（PHP）とトランスデュージングベクター（PTV）で構成されるレンチウイルスベクターシステムを特徴づけました。PHP、長期繰り返し（LTR）では、5 '翻訳されていないリーダーとENVおよびNEF遺伝子の一部が削除されました。PHPのリーダーシーケンスは、変異したRSV GAG AUGと機能的な5 'スプライス部位を含む修飾されたRous肉腫ウイルス（RSV）59 bpリーダーに置き換えられました。PHPコンストラクトは、野生型HIV-1と同じくらい効率的にGAG-POL合成を誘導することがわかった。PTVコンストラクトには、RNAパッケージ、逆転写、統合に必要な配列が含まれていますが、ウイルス遺伝子がありません。PHP、PTV、および小胞口内炎ウイルスG（VSV-G）エンベローププラスミドの同時トランスフェクションは、10（5）-10（6）1ミリリットルあたり48時間で単位を伝達する力価でベクターを生成しました。PHPのENV遺伝子で削除が行われた場合、複製能力ウイルス（RCV）は検出されませんでした。このベクトルシステムがin vitroおよびin vivoで分裂していない細胞を伝達する能力も実証されました。モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）ベクターと比較して、HP/TVベクターはヒト筋肉、腎臓、肝臓由来の細胞株、CD34+一次造血前駆細胞をより効率的に導入しました。PTV導入遺伝子発現のレベルは輸血後すぐに高かったが、発現はプロビラルDNAの喪失またはプロモーター活性の不活性化のいずれかのために時間とともに減少する傾向があり、これは細胞型依存であることがわかった。染色体外DNAの分析により、レンチウイルスベクターの統合されていないプロビラルDNAがレトロウイルスベクターのそれよりもはるかに長く生き残ることが示されました。HP/TVベクターは高効率変換が可能であり、レンチウイルスベクターの長期発現がターゲット細胞型、内部プロモーター、および導入ベクターの導入遺伝子自体に依存していることを実証します。

Lentiviruses infect both dividing and nondividing cells. In this study we characterized a lentiviral vector system consisting of a packaging vector (pHP) and a transducing vector (pTV) derived from a recombinant human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). In pHP, the long terminal repeats (LTRs), the 5' untranslated leader and portions of the env and nef genes were deleted. The leader sequence of pHP was substituted with a modified Rous sarcoma virus (RSV) 59 bp leader containing a mutated RSV gag AUG and a functional 5' splice site. The pHP construct was found to direct Gag-Pol synthesis as efficiently as wild-type HIV-1. The pTV construct contains sequences required for RNA packaging, reverse transcription and integration, but lacks viral genes. Co-transfection of pHP, pTV and a vesicular stomatitis virus G (VSV-G) envelope plasmid produced vectors at titers of 10(5)-10(6) transducing units per milliliter in 48 h. Replication-competent virus (RCV) was not detected when deletions were made in the env gene in pHP. The ability of this vector system to transduce dividing and nondividing cell in vitro and in vivo was also demonstrated. Compared with a Moloney murine leukemia virus (MLV) vector, the HP/TV vectors transduced human muscle-, kidney-, liver-derived cell lines and CD34+ primary hematopoietic progenitor cells more efficiently. Although the levels of the pTV transgene expression were high soon after transduction, the expression tended to decrease with time due either to the loss of proviral DNA or to the inactivation of promoter activity, which was found to be cell type-dependent. Analyses of extrachromosomal DNA showed that the unintegrated proviral DNA of lentiviral vectors survived much longer than that of the retroviral vectors. We demonstrate that the HP/TV vector is capable of high efficiency transduction and that long-term expression of lentiviral vectors is dependent on target cell type, the internal promoter and the transgene itself in the transducing vector.