大腸菌の配列認識特異性とDNA結合親和性からのヌクレオイド関連タンパク質の12種

大腸菌のゲノムは、約47,000キロベースのペアの長さの円形DNAの単一分子で構成されており、これは約10個の主要なDNA結合タンパク質に関連しており、完全にヌクレオイドを形成します。DNA結合タンパク質の12種、すなわちCBPA（湾曲したDNA結合タンパク質A）、CBPBまたはROB（湾曲したDNA結合タンパク質Bまたは複製起源結合タンパク質の右腕）、DNAA（DNA結合）を発現および精製しました。タンパク質A）、DPS（飢ved細胞からのDNA結合タンパク質）、FIS（反転刺激の因子）、HFQ（ファージQ（ベータ）の宿主因子）、H-NS（ヒストン様ヌクレオイド構造タンパク質）、HU（熱（熱） - 不安定なヌクレオイドタンパク質）、ICIA（染色体開始Aの阻害剤）、IHF（統合ホスト因子）、LRP（ロイシン応答性調節タンパク質）、およびSTPA（TD（ - ）表現型Aの抑制因子）。DNA結合の配列特異性は、ゲルモビリティシフトアッセイを使用して、すべての精製されたヌクレオイドタンパク質について決定されました。5つのタンパク質（CBPB、DNAA、FIS、IHF、およびLRP）が特定のDNA配列に結合することがわかりましたが、残りの7つのタンパク質（CBPA、DPS、HFQ、H-NS、HU、ICIA、およびSTPA）は明らかに配列を示しました - 非特異的DNA結合活性。4つのタンパク質、CBPA、HFQ、H-NS、およびICIAは、湾曲したDNAの結合選好を示しました。シーケンス固有または非特異的DNAプローブを使用して決定された見かけの解離定数（k（d））から、DNA結合親和性の順序は次のと判断されました。STPA> CBPA> ICIA> HFQ/DPS、25 nm（非線DNAへの結合）から250 nm（非線的なDNAへのHFQ結合）、使用されたアッセイ条件下で。

The genome of Escherichia coli is composed of a single molecule of circular DNA with the length of about 47,000 kilobase pairs, which is associated with about 10 major DNA-binding proteins, altogether forming the nucleoid. We expressed and purified 12 species of the DNA-binding protein, i.e. CbpA (curved DNA-binding protein A), CbpB or Rob (curved DNA-binding protein B or right arm of the replication origin binding protein), DnaA (DNA-binding protein A), Dps (DNA-binding protein from starved cells), Fis (factor for inversion stimulation), Hfq (host factor for phage Q(beta)), H-NS (histone-like nucleoid structuring protein), HU (heat-unstable nucleoid protein), IciA (inhibitor of chromosome initiation A), IHF (integration host factor), Lrp (leucine-responsive regulatory protein), and StpA (suppressor of td(-) phenotype A). The sequence specificity of DNA binding was determined for all the purified nucleoid proteins using gel-mobility shift assays. Five proteins (CbpB, DnaA, Fis, IHF, and Lrp) were found to bind to specific DNA sequences, while the remaining seven proteins (CbpA, Dps, Hfq, H-NS, HU, IciA, and StpA) showed apparently sequence-nonspecific DNA binding activities. Four proteins, CbpA, Hfq, H-NS, and IciA, showed the binding preference for the curved DNA. From the apparent dissociation constant (K(d)) determined using the sequence-specific or nonspecific DNA probes, the order of DNA binding affinity were determined to be: HU > IHF > Lrp > CbpB(Rob) > Fis > H-NS > StpA > CbpA > IciA > Hfq/Dps, ranging from 25 nM (HU binding to the non-curved DNA) to 250 nM (Hfq binding to the non-curved DNA), under the assay conditions employed.