C型肝炎ウイルスNS5Aタンパク質の高リン酸化には、同じポリタンパク質にエンコードされた活性NS3プロテアーゼ、NS4A、NS4B、およびNS5Aが必要です。

C型肝炎ウイルス（HCV）の非構造タンパク質NS5Aは、56 kDaの見かけの分子量を持つリンタンパク質であることが実証されています。他のウイルスタンパク質の存在下では、p56は追加のリン酸化イベントにより、ns5a（p58）の遅い形態に変換されます。このレポートでは、NS3、NS4A、およびNS4BのNS5Aと一緒にNS4Bの存在がNS5A（P58）の過剰リン酸化型の生成に必要かつ十分であり、すべてのタンパク質が同じポリプロテイン（CIS）にエンコードする必要があることを示しています。NS5A合成とパルスチェースの実験の速度論的研究は、完全に処理されたNS5Aがp58の形成の基質であり、p56がp58に変換されることを示しています。NS5aの過剰リン酸化におけるNS3の役割を調査するために、NS3からNS5Aへのタンパク質を含むポリタンパク質のコンテキストで、点と欠失変異をNS3に導入しました。アラニンへの触媒セリン残基のアラニンへの突然変異は、NS3のプロテアーゼ活性を廃止し、トランスでのNS3およびNS4Aの添加によりポリプロタンプロセシングが許可されたとしても、NS5A過リン酸化の全阻害をもたらしました。同じ結果は、NS3の最初の10または28のN末端アミノ酸の削除によって得られました。これは、NS3とその補因子NS4Aの間に安定した複合体の形成に重要であることが知られています。これらのデータは、p58の形成がHCVポリタンパク質処理イベントに密接に関連していることを示唆しています。NS2の34 C末端残基を含むNS3で得られた追加データは、NS3プロテアーゼ活性に加えて、NS5A過剰リン酸化に真正なN末端配列が必要であるという証拠を提供します。

The nonstructural protein NS5A of hepatitis c virus (HCV) has been demonstrated to be a phosphoprotein with an apparent molecular mass of 56 kDa. In the presence of other viral proteins, p56 is converted into a slower-migrating form of NS5A (p58) by additional phosphorylation events. In this report, we show that the presence of NS3, NS4A, and NS4B together with NS5A is necessary and sufficient for the generation of the hyperphosphorylated form of NS5A (p58) and that all proteins must be encoded on the same polyprotein (in cis). Kinetic studies of NS5A synthesis and pulse-chase experiments demonstrate that fully processed NS5A is the substrate for the formation of p58 and that p56 is converted to p58. To investigate the role of NS3 in NS5A hyperphosphorylation, point and deletion mutations were introduced into NS3 in the context of a polyprotein containing the proteins from NS3 to NS5A. Mutation of the catalytic serine residue into alanine abolished protease activity of NS3 and resulted in total inhibition of NS5A hyperphosphorylation, even if polyprotein processing was allowed by addition of NS3 and NS4A in trans. The same result was obtained by deletion of the first 10 or 28 N-terminal amino acids of NS3, which are known to be important for the formation of a stable complex between NS3 and its cofactor NS4A. These data suggest that the formation of p58 is closely connected to HCV polyprotein processing events. Additional data obtained with NS3 containing the 34 C-terminal residues of NS2 provide evidence that in addition to NS3 protease activity the authentic N-terminal sequence is required for NS5A hyperphosphorylation.