灌流培養における細胞分化の調節

in vitroモデルを使用して、胚から成体腎組織に至る末端分化メカニズムを調査しました。これらの実験では、接着性胚組織を伴うカプシュラフィブロサは、新生児ウサギ腎臓から分離されました。これらの外植片は、特別な組織キャリアに取り付けられ、培地で培養された血清を24時間培養しました。その間、ダクト（CD）細胞の収集は成長し、外植林の表面全体を覆う単層の上皮を形成しました。次に、キャリアを灌流培養容器に移して、最適な程度の分化を取得しました。特別なタイプの容器により、管腔および基底側の個々の培地と上皮を連続的に過吸収することができました。この方法を使用して、液体勾配で胚性CD上皮を数週間培養することが可能になりました。上皮には、基底側に標準のiScoveの改造されたダルベッコの培地（IMDM）と過灌流されましたが、追加のNaClを含むIMDMを管腔側に使用しました。コントロールでは、IMDMは管腔辺と基底辺の両方で灌流されていました。CD上皮の分化の程度は、液体勾配曝露の影響に依存していることがわかった。等張条件下での灌流培養により、細胞の5％未満が主要な細胞特徴と挿入された細胞の特徴について免疫陽性であることが明らかになりましたが、管腔塩基勾配で培養された上皮は80％以上の陽性細胞を示しました。特徴的なマーカーの免疫反応性は、予期せずに長い潜在期間の3〜6日の後に発生し始め、その後、次の5日間に連続的に増加し、14日目に最大に達しました。5日以内に減少しましたが、他の特徴的な特徴は安定したままでした。したがって、分化は成長因子の制御下にあるだけでなく、電解質環境によっても規制されていました。

An in vitro model was used to investigate the terminal differentiation mechanisms leading from embryonic to adult renal tissue. For these experiments the capsula fibrosa with adherent embryonic tissue was isolated from neonatal rabbit kidneys. These explants were mounted onto special tissue carriers and cultured in medium containing serum for 24 h. During that time collecting duct (CD) cells grew out and formed a monolayered epithelium covering the whole surface of the explant. The carriers were then transferred to perfusion culture containers to obtain an optimal degree of differentiation. A special type of container allowed us to continuously superfuse the epithelia with individual media on the luminal and basal sides. Using this method it became possible to culture embryonic CD epithelia in a fluid gradient for weeks. The epithelia were superfused with standard Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) on the basal side, while IMDM containing additional NaCl was used on the luminal side. In controls IMDM was superfused on both the luminal and basal sides. It was found that the degree of differentiation in the CD epithelia is dependent on the influence of fluid gradient exposure. Perfusion culture under isotonic conditions revealed that less than 5% of cells were immunopositive for principal and intercalated cell features, while epithelia cultured in a luminal-basal gradient showed more than 80% positive cells. Immunoreactivity for characteristic markers started to develop after an unexpectedly long latent period of 3-6 days, then increased continuously during the following 5 days and reached a maximum on day 14. After switching back from the gradient to isotonic culture conditions the immunoreactivity for some markers decreased within 5 days, while other characteristic features remained stable. Thus, differentiation was not only under the control of growth factors but was also regulated by the electrolyte environment.