大腸菌のRNA 3'末端リン酸シクラーゼにおけるアデニル化部位の特性評価

RNA 3'末端リン酸シクラーゼは、RNAの端にある3'-リン酸のATP依存性変換を2 '、3'環状ホスホジエスタへのATP依存性変換を触媒する進化的に保存された酵素のファミリーです。シクラーゼの正確な機能は知られていないが、それらは真核生物および原核生物のRNAリガーゼに必要な環状リン酸RNA末端を生成または再生する原因となる可能性がある。ヒトおよび大腸菌酵素で行われた以前の研究では、環化反応の最初のステップにはタンパク質のアデニル化が含まれることが実証されました。次に、AMP基はRNAの3'-リン酸に移動し、RNA-N（3 '）pp（5'）a（nは任意のヌクレオシド）中間体を生成し、最終的に環化されます。この研究では、異なるプロテアーゼ消化と質量分析を使用することにより、大腸菌シクラーゼのアデニル化部位をHIS-309に割り当てます。このヒスチジンは、系統解析によって特定されたサイクラーゼのクラスIサブファミリーのすべてのメンバーで保存されています。His-309をアスパラギンまたはアラニンに置き換えると、モデルRNA基質における3'末端リン酸の酵素 - アデニル酸形成と環化の両方を廃止します。シクラーゼは、ヒスチジン残基でアデニル化を受けている唯一の既知のタンパク質です。シクラーゼのアデニル化ヒスチジンに隣接する配列は、ヌクレオチジル化によって修飾された他のタンパク質に見られるものに似ていません。

RNA 3'-terminal phosphate cyclases are a family of evolutionarily conserved enzymes that catalyze ATP-dependent conversion of the 3'-phosphate to the 2',3'-cyclic phosphodiester at the end of RNA. The precise function of cyclases is not known, but they may be responsible for generating or regenerating cyclic phosphate RNA ends required by eukaryotic and prokaryotic RNA ligases. Previous work carried out with human and Escherichia coli enzymes demonstrated that the initial step of the cyclization reaction involves adenylation of the protein. The AMP group is then transferred to the 3'-phosphate in RNA, yielding an RNA-N(3')pp(5')A (N is any nucleoside) intermediate, which finally undergoes cyclization. In this work, by using different protease digestions and mass spectrometry, we assign the site of adenylation in the E. coli cyclase to His-309. This histidine is conserved in all members of the class I subfamily of cyclases identified by phylogenetic analysis. Replacement of His-309 with asparagine or alanine abrogates both enzyme-adenylate formation and cyclization of the 3'-terminal phosphate in a model RNA substrate. The cyclase is the only known protein undergoing adenylation on a histidine residue. Sequences flanking the adenylated histidine in cyclases do not resemble those found in other proteins modified by nucleotidylation.