相同組換えによるES細胞に正確な遺伝的変化を導入する効率に影響する要因：タグと交換とCRE-LOXPシステムと

相同組換えによる特定の遺伝子における遺伝子修飾の導入は、生物学的関心のタンパク質の構造機能関係を解明するための強力なツールを提供します。現在、特定の遺伝子座に小さな遺伝子修飾の導入を可能にする相同組換えのいくつかの代替方法があります。最も広く使用されている2つの方法は、陽性陰性選択マーカーの使用に基づいたタグと交換と、サイト固有のリコンビナーゼの使用に基づくCre-Loxpシステムです。2つのシステムを使用して、異なる遺伝子座でのターゲティングイベントの検出効率を比較しました。さらに、ターゲティングベクターの相同性領域内に配置された2つの遺伝子マーカー間の距離が、相同組換えイベント中に両方のマーカーが遺伝子座に導入される速度にどのように影響するかを分析しました。我々の結果は、陽性選択マーカーの使用に基づく方法は、遺伝子座や正の陰性選択の種類に関係なく、CRE-LOXPベースのシステムよりも効率が低かったことを示しています。また、選択可能なマーカーと導入された遺伝子修飾の間の距離が増加すると、望ましい遺伝子修飾を伴うイベントを検出する効率が進行的に低下すると判断されました。

The introduction of genetic modifications in specific genes by homologous recombination provides a powerful tool for elucidation of structure-function relationships of proteins of biological interest. Presently, there are several alternative methods of homologous recombination that permit the introduction of small genetic modifications in specific loci. Two of the most widely used methods are the tag-and-exchange, based on the use of positive-negative selection markers, and the Cre-loxP system, based on the use of a site-specific recombinase. The efficiency of detection of targeting events at different loci using the two systems was compared. Additionally, we analysed how the distance between two gene markers placed within the region of homology of a targeting vector affects the rate at which both markers are introduced into the locus during the homologous recombination event. Our results indicate that the method based on the use of positive-negative selection markers was less efficient than the Cre-loxP based system, irrespective of locus or type of positive-negative selection. It was also determined that as the distance between the selectable marker and the genetic modification being introduced increases, there is a progressive reduction in the efficiency of detecting events with the desired genetic modification.