スプライシング係数U2AF35による3 'スプライスサイトAGの機能認識

後生動物では、スプライセソームアセンブリは、U1 SNRNPによる5 'スプライス部位とU2小さな核リボ核タンパク質粒子（SNRNP）補助因子U2AFによるポリピリミジン路の認識を通じて開始されます。U2AFは、大きなサブユニット、U2AF65、および小さなサブユニット、U2AF35を含むヘテロダイマーです。U2AF65はポリピリミジン路に直接接触し、in vitroでのスプライシングに必要です。それに比べて、U2AF35の役割は困惑しています。U2AF35は高度に保存されており、実行可能性に必要ですが、in vitroでスプライシングするために分配できます。ここでは、部位固有の架橋を使用して、スプライセソームアセンブリU2AF35が3 'スプライスサイトに直接接触していることを示します。変異解析とin vitro遺伝的選択は、U2AF35が3'-スプライスサイトコンセンサスAg/gを認識する配列固有のRNA結合活性を持っていることを示しています。ポリピリミジンが弱いイントロンの場合、U2AF35-3'-スプライスサイトの相互作用がU2AF結合とスプライシングに重要であることを示します。我々の結果は、U2AF35の新しい生化学的活性を示し、最初に3 'スプライス部位を認識している要因を特定し、すべてではなく一部ではなく一部のスプライシングの最初のステップにAGジヌクレオチドが必要な理由を説明します。

In metazoans, spliceosome assembly is initiated through recognition of the 5' splice site by U1 snRNP and the polypyrimidine tract by the U2 small nuclear ribonucleoprotein particle (snRNP) auxiliary factor, U2AF. U2AF is a heterodimer comprising a large subunit, U2AF65, and a small subunit, U2AF35. U2AF65 directly contacts the polypyrimidine tract and is required for splicing in vitro. In comparison, the role of U2AF35 has been puzzling: U2AF35 is highly conserved and is required for viability, but can be dispensed with for splicing in vitro. Here we use site-specific crosslinking to show that very early during spliceosome assembly U2AF35 directly contacts the 3' splice site. Mutational analysis and in vitro genetic selection indicate that U2AF35 has a sequence-specific RNA-binding activity that recognizes the 3'-splice-site consensus, AG/G. We show that for introns with weak polypyrimidine tracts, the U2AF35-3'-splice-site interaction is critical for U2AF binding and splicing. Our results demonstrate a new biochemical activity of U2AF35, identify the factor that initially recognizes the 3' splice site, and explain why the AG dinucleotide is required for the first step of splicing for some but not all introns.