複雑な膜タンパク質のNMRベースのアミド水素交換測定：発達と批判的評価

二重層の膜タンパク質の部位特異的なアミド水素消費量交換レートを測定する方法が報告され、評価されています。この方法は、デンプシーと同僚のアプローチの適応と拡張を表しています（Biophys。J。70、1777-1788（1996））は、（15）n標識膜タンパク質へのリン脂質二重層への再構成に基づいており、その後は溶解が続きます。およびd（2）oまたはh（2）o（コントロール）による再水和。水分補給条件下での時間tのインキュベーション後、サンプルは再び凍結乾燥し、次に有機溶媒システムに可溶化されます。ここで、（1）H-（15）N HSQCスペクトルが記録されます。D（2）Oに露出したサンプルからのスペクトルの比較対照サンプルからのスペクトルとの比較により、時間の間に二重層で発生したH-d交換の程度が得られます。測定は、特定（15）n標識が使用される場合、サイト固有です。このペーパーの最初の部分は、アミドピーク強度のNMR定量のためにアミドの「交換閉じ込め」形態で複雑な膜タンパク質を溶解する適切な溶媒システムの検索を扱います。紙の2番目の部分は、代表的な膜タンパク質であるジアシルグリセロールキナーゼの部位固有のアミド為替レートを測定するための全体的な手順の適用を文書化します。潜在的な有用性と新しい方法の重要な制限の両方が文書化されています。

A method for measuring site-specific amide hydrogen-deuterium exchange rates for membrane proteins in bilayers is reported and evaluated. This method represents an adaptation and extension of the approach of Dempsey and co-workers (Biophys. J. 70, 1777-1788 (1996)) and is based on reconstituting (15)N-labeled membrane proteins into phospholipid bilayers, followed by lyophilization and rehydration with D(2)O or H(2)O (control). Following incubation for a time t under hydrated conditions, samples are again lyophilized and then solubilized in an organic solvent system, where (1)H-(15)N HSQC spectra are recorded. Comparison of spectra from D(2)O-exposed samples to spectra from control samples yields the extent of the H-D exchange which occurred in the bilayers during time t. Measurements are site specific if specific (15)N labeling is used. The first part of this paper deals with the search for a suitable solvent system in which to solubilize complex membrane proteins in an amide "exchange-trapped" form for NMR quantitation of amide peak intensities. The second portion of the paper documents application of the overall procedure to measuring site-specific amide exchange rates in diacylglycerol kinase, a representative integral membrane protein. Both the potential usefulness and the significant limitations of the new method are documented.