ラット肝臓のニコチンアミドポケット残留物3アルファヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの変異により、異なるモードの補因子結合が明らかになります

ラット肝臓3alpha-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（3alpha-HSD）は、アルドケト還元酵素であり、（8）バレル（8）バレル全体の拡張防止抗変換でNADP（+）に結合します。NAD（P）Hから基質への4-Pro-R水素化物の立体特異的伝達を可能にするニコチンアミド環の方向は、ニコチンアミド環とSer 166、ASN 167、およびGLN 190のC3-カルボキサミドとGLN 190、およびこれらの環が216aのPi ringとTirの間のPi-stackingの間で形成された水素結合によって達成されました。N167A、Q190A、およびY216S。これらの変異体では、k（d）（NADP（h））は2〜11倍増加しましたが、k（d）（nad（h））に有意な変化はありませんでした。定常状態の運動パラメーターは、K（M）（NADP）（）+が13-151倍増加することを示し、これにはK（CAT）/K（M）（NADP）（）+の同等の減少が伴いました。対照的に、k（m）（nad）（）+は4-8倍増加しましたが、k（cat）/k（m）（nad）（）+の変化はより劇的で、23〜930倍の範囲でした。結合エネルギーの対応する変化は、各残基が地面および遷移状態におけるNADP（H）の結合に等しく寄与したことを示しています。ただし、同じ残基が遷移状態でのみNAD（h）の結合を安定させました。これらの観察結果は、NADP（H）およびNAD（H）にさまざまな結合モードが存在することを示唆しています。重要なことに、これらのモードは、アデニンモノヌクレオチドの2'-リン酸との直接的な相互作用が補因子の好みの唯一の決定因子ではないことを示すニコチンアミドポケット内の残基を変異させることによって明らかにされました。ニコチンアミドポケットは、必要な水素結合が排除されると、ニコチンアミドポケットが抗結合とシンコンフォーザーの両方に対応できるにもかかわらず、単一の変異は水素化物の立体化学を反転またはろ過することができませんでした。4-Pro-R- [（3）H] NADHを使用して[（14）C] -5アルファジヒドロテストステロンへの取り込みを監視した場合、（3）H：（14）C比の減少が、発音された原発性キニ系アイソトープ効果を反映した野生型酵素と比較して変異体で観察されました。この観察結果は、遷移状態のNAD（P）（H）の結合エネルギーの変化と相まって、これらの変異体が水素化物移動の反応軌道を変化させたことを示唆しています。

Rat liver 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase (3alpha-HSD), an aldo-keto reductase, binds NADP(+) in an extended anti-conformation across an (alpha/beta)(8)-barrel. The orientation of the nicotinamide ring, which permits stereospecific transfer of the 4-pro-R hydride from NAD(P)H to substrate, is achieved by hydrogen bonds formed between the C3-carboxamide of the nicotinamide ring and Ser 166, Asn 167, and Gln 190 and by pi-stacking between this ring and Tyr 216. These residues were mutated to yield S166A, N167A, Q190A, and Y216S. In these mutants, K(d)(NADP(H)) increased by 2-11-fold but without a significant change in K(d)(NAD(H)). Steady-state kinetic parameters showed that K(m)(NADP)()+ increased 13-151-fold, and this was accompanied by comparable decreases in k(cat)/K(m)(NADP)()+. By contrast, K(m)(NAD)()+ increased 4-8-fold, but changes in k(cat)/K(m)(NAD)()+ were more dramatic and ranged from 23- to 930-fold. Corresponding changes in binding energies indicated that each residue contributed equally to the binding of NADP(H) in the ground and transition states. However, the same residues stabilized the binding of NAD(H) only in the transition state. These observations suggest that different modes of binding exist for NADP(H) and NAD(H). Importantly, these modes were revealed by mutating residues in the nicotinamide pocket indicating that direct interactions with the 2'-phosphate in the adenine mononucleotide is not the sole determinant of cofactor preference. The single mutations were unable to invert or racemize the stereochemistry of hydride transfer even though the nicotinamide pocket can accommodate both anti- and syn-conformers once the necessary hydrogen bonds are eliminated. When 4-pro-R-[(3)H]NADH was used to monitor incorporation into [(14)C]-5alpha-dihydrotestosterone, a decrease in the (3)H:(14)C ratio was observed in the mutants relative to wild-type enzyme reflecting a pronounced primary kinetic isotope effect. This observation coupled with the change in the binding energy for NAD(P)(H) in the transition state suggests that these mutants have altered the reaction trajectory for hydride transfer.