アフリカアキセノパスレーヴィスのエンドヌクレアーゼの標的特異性非長末端リピートレトロトランスポゾン、TX1L

TX1Lファミリーの要素は、アフリカツメガエルレーヴィスのゲノムに分散されている長い末端リピートレトロトランスポゾン（NLR）です。基本的に、TX1Lのすべてのゲノムコピーは、転位要素の別のファミリー（TX1D）内の特定のサイトに挿入されていることがわかります。これは、Tx1Lがサイト固有のレトロトランスポゾンであることを示唆しています。他の多くのNLRと同様に、Xenopus要素は、DNA修復に関与するアプリニックアピリミジン性エンドヌクレアーゼに関連して関連する見かけのエンドヌクレアーゼをコードします。この酵素は、ターゲットプライミングされた逆転写（TPRT）メカニズムによって転位を開始する標的DNAの一本鎖切断を導入すると考えられています。ターゲットの特異性の問題をより完全に調査するために、TX1L（TX1L EN）のオープンリーディングフレーム2のエンドヌクレアーゼドメインによってコードされるポリペプチドを発現し、その切断能力を特徴づけました。このエンドヌクレアーゼは、推定されるTX1Lターゲットの複製の一端に正確に底鎖に特定のニックを作ります。この活動は、ニックに5'-リン酸と3'-ヒドロキシルを残すため、TPRTによる新しい挿入イベントを開始するために必要な場所と化学があります。TX1L ENは、TX1D要素の優先ターゲットサイトで特定のカットを行わず、複合TX1L-TX1D要素がTX1Lによってエンコードされた関数の制御下でユニットとして移動する代替の可能性を排除します。さらなる特性評価により、エンドヌクレアーゼは室温で何時間も活動したままであり、酵素的な代謝回転が可能であることが明らかになりました。スキャン置換変異誘発は、主要なニックサイトを囲む10 bp以内のTx1L Enの認識部位を見つけました。自然転位イベントに対するこれらの機能の意味について説明します。

Elements of the Tx1L family are non-long terminal repeat retrotransposons (NLRs) that are dispersed in the genome of Xenopus laevis. Essentially all genomic copies of Tx1L are found inserted at a specific site within another family of transposable elements (Tx1D). This suggests that Tx1L is a site-specific retrotransposon. Like many (but not all) other NLRs, the Xenopus element encodes an apparent endonuclease that is related in sequence to the apurinic-apyrimidinic endonucleases that participate in DNA repair. This enzyme is thought to introduce the single-strand break in target DNA that initiates transposition by the target-primed reverse transcription (TPRT) mechanism. To explore the issue of target specificity more fully, we expressed the polypeptide encoded by the endonuclease domain of open reading frame 2 from Tx1L (Tx1L EN) and characterized its cleavage capabilities. This endonuclease makes a specific nick in the bottom strand precisely at one end of the presumed Tx1L target duplication. Because this activity leaves a 5'-phosphate and 3'-hydroxyl at the nick, it has the location and chemistry required to initiate new insertion events by TPRT. Tx1L EN does not make a specific cut at a preferred target site for Tx1D elements, ruling out the alternative possibility that the composite Tx1L-Tx1D element moves as a unit under the control of functions encoded by Tx1L. Further characterization revealed that the endonuclease remains active for many hours at room temperature and that it is capable of enzymatic turnover. Scanning substitution mutagenesis located the recognition site for Tx1L EN within 10 bp surrounding the primary nick site. Implications of these features for natural transposition events are discussed.