ウシ血清タンパク質に対するヘテロファイル抗体によって引き起こされる抗内皮細胞抗体の細胞ELISAの偽陽性

背景：固定内皮細胞または細胞株を持つELISAは、抗内皮細胞抗体（AECA）の広く使用されているスクリーニング試験ですが、偽の増加が起こります。ヘテロ抗体による干渉とそれらを排除する手段を調べました。 方法：AECAは、ウシ血清アルブミンで希釈された60の患者血清サンプルのパネルで、EA.HY 926のヒト内皮細胞株の固定層でELISAによって測定されました。胎児の子牛血清（FCS）タンパク質に対するヘテロ抗体が実証され、ELISA-The干渉アッセイが使用されているFCSコーティングされたプレートと、ブロッキング剤およびサンプル希釈剤として、および免疫ブロットのサンプルとして20含有バッファーが使用されました。 結果：60の患者血清サンプルのうち12で、AECA力価のスプリアス増加は、細胞播種時に固相にコーティングされた培地からFCSタンパク質と反応する内因性抗体によって生成されました。この干渉のメカニズムは、細胞外マトリックスを露出させ、細胞密度を変化させ、FCSのみとウェルをインキュベートすることにより、実験的にサポートされました。ヘテロファイル抗体は主にIgGとIgAであり、阻害実験では、ヤギ、羊、馬の血清タンパク質を認識しました。めっき前にFCSを含まない細胞を洗浄するか、患者サンプル希釈液にFCS（100 mL/L）を追加して、30のテストされた血清すべてから偽の信号を排除しましたが、後者の方法には実際的な利点がありました。 結論：動物血清タンパク質に対する抗体は、細胞ELISAでの誤った結果の頻繁な原因です。干渉は、FCS含有希釈バッファーの単純な抗体吸収によって排除できます。

BACKGROUND: ELISAs with fixed endothelial cells or cell lines are widely used screening tests for anti-endothelial cell antibodies (AECAs), but spurious increases occur. We examined interferences by heteroantibodies and means to eliminate them. METHODS: AECAs were measured by ELISA on fixed layers of the human endothelial cell line, EA.hy 926, in a panel of 60 patient serum samples diluted in bovine serum albumin. Heteroantibodies against fetal calf serum (FCS) proteins were demonstrated and characterized in an ELISA-the interference assay-that used FCS-coated plates and Tween 20-containing buffer as blocking agent and sample diluent, as well as by immunoblotting. RESULTS: In 12 of 60 patient serum samples, spurious increases of AECA titers were produced by endogenous antibodies reacting with FCS proteins from culture medium that were coated onto the solid-phase at the time of cell plating. This mechanism of interference was supported experimentally by exposing extracellular matrix, varying cell density, and incubating wells with FCS alone. The heterophile antibodies were mainly IgG and IgA, and in inhibition experiments, they recognized serum proteins from goat, sheep, and horse. Washing cells free of FCS before plating, or adding FCS (100 mL/L) to the patient sample diluent eliminated spurious signals from all 30 tested sera, but the latter method had practical advantages. CONCLUSIONS: Antibodies against animal serum proteins are a frequent cause of erroneous results in cyto-ELISAs. The interference can be eliminated by simple antibody absorption in FCS-containing dilution buffer.