大腸菌エンテロバクチン合成酵素のENTFおよびENTEアデニル化ドメイン：アシルAMP透過率における隔離と選択性

エンテロバクチン、トリス - （2,3-ジヒドロキシベンゾイル）セリン）トリラクトンシデラフォア大腸菌は、3タンパク質（ENTE、B、F）6モジュール非リボソームペプチドシンセターゼ（NRPS）によって合成されます。この研究では、142-kDaの4ドメインタンパク質ENTFを2つの二重ドメインフラグメントに分割しました：108 kDA凝縮とアデニル化コンストラクト、ENTF C-A、および37-kDAペプチジルキャリアタンパク質（PCP）およびチオエステラーゼタンパク質、ENTFPCP-TE。ENTF C-Aのアデニル化ドメイン活性は、セリル-AMPを形成しましたが、トランスのCognate ENTF PCP-TEにセリル部分を伝達する能力を失いました。異種PCPタンパク質フラグメントへのセリル移動、Yersiniabactin SynthetaseのSurfactin SynthetaseのSrfB1 PCPおよびYBT PCP1は、それぞれ0.5分（-1）および0.01分（-1）の速度で観察されました。これらの遅いアシル化速度がアシル/アミノアシル-AMPの解離を反映した可能性は、溶液中の異種PCPによる不定のチオレーションに続いて、アデニル化ドメインから放出されるピロリン酸（PP（I））の触媒上昇率を測定することにより対処されました。Holo SRFB1 PCPタンパク質とYBT PCP1は、ENTF C-AまたはENTEからのPP（I）放出の増加を刺激しませんでした。この観点から、NRPSアセンブリラインのAとPCPドメインの間のトランスのアミノアシル化は、動力学的精査を受けて、タンパク質ドメインの真の間の伝達であるか、アミノアシル-AMP放出が遅いこととその後の非酵素チオール捕捉の結果であるかを判断する必要があります。

Enterobactin, the tris-(N-(2,3-dihydroxybenzoyl)serine) trilactone siderophore of Escherichia coli, is synthesized by a three-protein (EntE, B, F) six-module nonribosomal peptide synthetase (NRPS). In this work, the 142-kDa four-domain protein EntF was bisected into two double-domain fragments: a 108-kDa condensation and adenylation construct, EntF C-A, and a 37-kDa peptidyl carrier protein (PCP) and thioesterase protein, EntF PCP-TE. The adenylation domain activity of EntF C-A formed seryl-AMP but lost the ability to transfer the seryl moiety to the cognate EntF PCP-TE in trans. Seryl transfer to heterologous PCP protein fragments, the SrfB1 PCP from surfactin synthetase and Ybt PCP1 from yersiniabactin synthetase, was observed at rates of 0.5 min(-1) and 0.01 min(-1), respectively. The possibility that these slow acylation rates reflected dissociation of acyl/aminoacyl-AMP followed by adventitious thiolation by the heterologous PCPs in solution was addressed by measuring catalytic turnover of pyrophosphate (PP(i)) released from the adenylation domain. The holo SrfB1 PCP protein as well as Ybt PCP1 did not stimulate an increase in PP(i) release from EntF C-A or EntE. In this light, aminoacylations in trans between A and PCP domain fragments of NRPS assembly lines must be subjected to kinetic scrutiny to determine whether transfer is truly between protein domains or results from slow aminoacyl-AMP release and subsequent nonenzymatic thiol capture.