フィターゼと酸性ホスファターゼの両方の活動を示すエセリチア大腸菌APPAエンコードされた二機能酵素の特性評価と過剰生産

以前に酸ホスファターゼをコードすることが以前に示されていたAPPA遺伝子は、代わりに酸ホスファターゼとフィターゼ活性の両方を示す二機能酵素をコードします。44,708 Daの分子量を持つ精製酵素は、クロマトフォームを同一のサイズの2つのアイソフォームに6.5および6.3の等電点にさらに分離しました。アイソフォームは同一のpH最適化4.5で、2〜10のpH値で安定していました。両方のフィターゼアイソフォームの温度が60度Cでした。異なるpH値で加熱すると、酵素はpH 3で最大の熱抵抗を示しました。6.5アイソフォームは、k（m）およびvmax値0.79 mmおよび3165のvmax値のタンパク質のU.MG-1、酸ホスファターゼのそれぞれ5.5 mmおよび712 U.MG-1のタンパク質のタンパク質と712 U.MG-1を示しました。pH 6.3アイソフォームは、わずかに低いK（M）およびVMAX値を示しました。酵素は、Greiner et alによって精製されたフィターゼと同様の特性を示しました。（1993）、酵素の特定の活性は、以前に報告されたものより少なくとも3.5倍少なく、N末端アミノ酸配列は異なっていました。Greiner et alが使用したBradfordアッセイ。（1993）酵素濃度の測定については、T7ポリメラーゼ発現系を使用したフィターゼ産生を14倍の因子で過小評価していました。炭素源とインデューサー。FEDバッチ発酵でこの株を使用して、フィターゼの産生は600以上のU.ML-1に増加しました。低pHの最適、プロテアーゼ耐性、および高い活性を含むフィターゼの特性は、酵素が飼料酵素としての工業生産の良い候補であることを示しています。

The appA gene that was previously shown to code for an acid phosphatase instead codes for a bifunctional enzyme exhibiting both acid phosphatase and phytase activities. The purified enzyme with a molecular mass of 44,708 Da was further separated by chromatofocusing into two isoforms of identical size with isoelectric points of 6.5 and 6.3. The isoforms had identical pH optima of 4.5 and were stable at pH values from 2 to 10. The temperature optimum for both phytase isoforms was 60 degrees C. When heated at different pH values the enzyme showed the greatest thermal resistance at pH 3. The pH 6.5 isoform exhibited K(m) and Vmax values of 0.79 mM and 3165 U.mg-1 of protein for phytase activity and 5.5 mM and 712 U.mg-1 of protein for acid phosphatase, respectively. The pH 6.3 isoform exhibited slightly lower K(m) and Vmax values. The enzyme exhibited similar properties to the phytase purified by Greiner et al. (1993), except the specific activity of the enzyme was at least 3.5-fold less than that previously reported, and the N-terminal amino acid sequence was different. The Bradford assay, which was used by Greiner et al. (1993) for determination of enzyme concentration was, in our hands, underestimating protein concentration by a factor of 14. Phytase production using the T7 polymerase expression system was enhanced by selection of a mutant able to grow in a chemically defined medium with lactose as the carbon source and inducer. Using this strain in fed-batch fermentation, phytase production was increased to over 600 U.mL-1. The properties of the phytase including the low pH optimum, protease resistance, and high activity, demonstrates that the enzyme is a good candidate for industrial production as a feed enzyme.