Far Red Spectral領域の蛍光エネルギー移動に基づく柱後反応検出

列後の反応検出により、分析感度と選択性が向上する可能性があります。このホワイトペーパーでは、モデル分析物としてビオチンを使用した柱後の蛍光エネルギー伝達アッセイを備えたオンラインHPLCについて説明します。R-フィコエリトリンで標識されたビオチンは、アクセプター標識バインダータンパク質であるインドディカルボシアニン色素（CY5）で標識されたリガンドとストレプトアビジンの標識標識標識リガンドとして使用されました。これらのラベルの使用は、生物学的サンプルにより選択的である、はるかに赤いスペクトル領域で検出波長を提供しました。オンラインシステムでは、ビオチンをHPLCシステムに注入し、その後、Cy5標識ストレプトアビジンとR-フィコーリスリン標識ビオチン、ポストカラムを標識しました。混合物を37度Cに維持した開いた管状反応器コイルでオンラインでインキュベートした。測定された応答は、670 nmで測定されたビオチン標識r-フィコエリトリンからの蛍光エネルギー移動によるCy5の感作放出でした。励起は488 nmで、散布干渉の減少のために大きなストークスシフトを提供しました。このシステムは、ポストカラム試薬に関して最適化され、ビオチンの分析に適切な動的範囲を維持しながら、最小検出可能な濃度を取得しました。0.01 Mリン酸緩衝液PH 7.4でスパイクされたビオチンは、0.993の相関係数を持つ304.0 pg/ml-122.20 ng/mlの動的範囲を示しました。このアッセイの検出限界は304.0 pg/mlでした。ブランク（n = 6）で計算された精度は4.14％でした。

Post-column reaction detection may result in enhanced analytical sensitivity and selectivity. This paper describes an on-line HPLC with post-column fluorescence energy transfer assay using biotin as a model analyte. Biotin labeled with R-phycoerythrin was used as the donor labeled ligand and streptavidin labeled with an indodicarbocyanine dye (Cy5), the acceptor labeled binder protein. The use of these labels provided a detection wavelength in the far red spectral region which is more selective for biological samples. In the on-line system, biotin was injected into the HPLC system followed by Cy5 labeled streptavidin and R-phycoerythrin labeled biotin, post-column. The mixture was incubated on-line in an open tubular reactor coil maintained at 37 degrees C. The measured response was the sensitized emission of Cy5 due to fluorescence energy transfer from R-phycoerythrin labeled biotin measured at 670 nm. Excitation was at 488 nm, which provided a large Stokes shift for reduction of scatter interference. The system was optimized with regard to the post-column reagents to obtain the minimum detectable concentration while maintaining appropriate dynamic range for the analysis of biotin. Biotin spiked in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.4, showed a dynamic range of 304.0 pg/ml-122.20 ng/ml with a correlation coefficient of 0.993. The limit of detection for this assay was 304.0 pg/ml. The precision calculated at the blank (n = 6) was 4.14%.