FASは培養HRPE細胞におけるアポトーシスと酸化剤誘発細胞死を媒介します

目的：FASリガンド（FASL）とFAS受容体系が培養されたヒト網膜色素上皮（HRPE）細胞のアポトーシスを媒介し、HRPE細胞の酸化剤誘発性死に寄与するかどうかを調査する。 方法：培養HRPE細胞におけるFASLおよびFASの発現は、ウエスタンブロット分析とフローサイトメトリーによって調べられました。FAS媒介アポトーシスに対するHRPE細胞の感受性は、組換え可溶性FASリガンド（SFASL）とインキュベートすることにより決定されました。評価されたアポトーシスの特徴には、クロマチン凝縮、DNA切断、ホスファチジルセリン曝露が含まれていました。HRPE細胞の酸化殺害におけるFAS媒介アポトーシスの可能性のある関与を調査するために、FASLおよびFASの発現に対する酸化剤Tert-ブチルヒドロペルオキシド（TBH）の効果を研究しました。酸化剤の効果の特異性は、抗酸化物質グルタチオンとn-アセチル-L-チェステイン（NAC）を使用して調べられました。TBH誘発アポトーシスにおけるFAS経路の要件は、FASLとFASの相互作用をブロックする拮抗的な抗FAS抗体ZB4を使用して調査されました。 結果：培養HRPE細胞はFASLおよびFASを構成的に発現しました。組換えSFASLを使用したFAS受容体のライゲーションは、HRPE細胞でアポトーシスを引き起こしました。HRPE細胞のTBH治療により、FASLとFASの発現が増加しました。グルタチオンとNACは、FASLおよびFAS発現およびアポトーシスのTBH誘発性の増加を完全に廃止しました。ZB4によるFASLおよびFAS相互作用のブロックは、TBH誘発アポトーシスを阻害しましたが、部分的にしか阻害されませんでした。 結論：機能的なFASを介したアポトーシス経路は、培養HRPE細胞に存在し、SFASLで活性化するか、FASLおよびFAS発現の酸化剤を上方制御することで活性化できます。抗体をブロックすることによる不完全阻害は、FAS経路が酸化剤誘発アポトーシスに関与していることを示していますが、他のトリガーメカニズムも重要です。

PURPOSE: To investigate whether Fas ligand (FasL) and the Fas receptor system mediates apoptosis in cultured human retinal pigment epithelial (hRPE) cells and contributes to oxidant-induced death of hRPE cells. METHODS: Expression of FasL and Fas in cultured hRPE cells was examined by Western blot analysis and flow cytometry. The susceptibility of hRPE cells to Fas-mediated apoptosis was determined by incubating cells with recombinant soluble Fas ligand (sFasL). Characteristics of apoptosis assessed included chromatin condensation, DNA cleavage, and phosphatidylserine exposure. To investigate the possible involvement of Fas-mediated apoptosis in oxidative killing of hRPE cells, the effects of the oxidant tert-butylhydroperoxide (tBH) on the expression of FasL and Fas were studied. The specificity of effects of oxidant was examined using the antioxidants glutathione and N-acetyl-L-cysteine (NAC). The requirement for the Fas pathway in tBH-induced apoptosis was investigated using an antagonistic anti-Fas antibody ZB4 that blocks the interaction between FasL and Fas. RESULTS: Cultured hRPE cells constitutively expressed FasL and Fas. Ligation of Fas receptor with recombinant sFasL triggered apoptosis in hRPE cells. tBH treatment of hRPE cells resulted in increased expression of FasL and Fas. Glutathione and NAC completely abrogated tBH-induced increase in FasL and Fas expression and apoptosis. Blocking FasL and Fas interaction by ZB4 inhibited tBH-induced apoptosis, but only partially. CONCLUSIONS: A functional Fas-mediated apoptotic pathway is present in cultured hRPE cells and can be activated with sFasL or by upregulation of FasL and Fas expression with an oxidant. The incomplete inhibition by blocking antibody indicates that the Fas pathway is involved in oxidant-induced apoptosis, but other triggering mechanisms are also important.