蛍光ベースの非放射性電気泳動移動度シフトアッセイ

電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）またはゲルシフトアッセイは、タンパク質DNA相互作用を研究するための最も強力な方法の1つです。通常、目的のタンパク質に結合した配列を含む32p標識DNAプローブは、EMSA（REMSA）で使用されます。REMSAは敏感で実行可能ですが、危険な放射性同位体の取り扱いに依存しており、定量化を簡単に許可しません。オリゴデオキシヌクレオチド二重鎖を特定のプローブ（FEMSA）と分析のための自動DNAシーケンサーと標識した蛍光（Cyano染料Cy5）を使用して、非放射性手順を開発しました。異なるDNA結合タンパク質（制限エンドヌクレアーゼECORII、転写因子Nfkappab、およびItsサブユニットP50）のテストは、FEMSAおよびREMSAの結果が品質、再現性、および感度に関して類似しています。FEMSAは、特定のDNA結合活性のための大量のサンプルの半定量的スクリーニングを可能にするため、DNAタンパク質相互作用の半定量分析のための高スループット技術です。

Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) or gel shift assay is one of the most powerful methods for studying protein-DNA interactions. Typically, 32P-labeled DNA probes containing the sequence bound by the protein of interest are used in EMSA (rEMSA). Although rEMSA is sensitive and practicable, it relies on the handling of hazardous radioisotopes, and does not easily allow quantification. We developed a non-radioactive procedure using fluorescence (Cyano dye Cy5) labeled oligodeoxynucleotide duplexes as specific probes (fEMSA) and an automatic DNA sequencer for analysis. Testing different DNA-binding proteins (restriction endonuclease EcoRII, transcription factor NFkappaB and it's subunit p50) the results in fEMSA and rEMSA are similar in regard to quality, reproducibility, and sensitivity. fEMSA allows a semiquantitative screening of large amounts of samples for specific DNA binding activities and is, therefore, a high throughput technology for semiquantitative analysis of DNA-protein interaction.