基本領域/ロイシンジッパータンパク質モチーフに基づいた短い、疎水性、アラニンベースのタンパク質：過剰発現、精製、および再飽和度中の包含体の形成とタンパク質凝集を克服する

GCN4は酵母転写調節タンパク質です。そのDNA結合ドメインは、基本的な領域/ロイシンジッパー（BZIP）構造であり、DNAメジャーグルーブの高親和性、配列固有の認識が可能なアルファヘリックスの二量体を構成します。私たちは、BZIPモチーフを分子認識の足場として操作することによって、自然が進化したことを活用しています。したがって、エレガントに最小限のBZIPを、アラニン残基の置換により、さらに単純化された構造に減らしました。これらのALAベースの変異体は、短い（約100個のアミノ酸）および疎水性（ALA-mutated Basic領域、ロイシンジッパー二量体化ドメイン）であるため、発現のための異常なタンパク質です。疎水性は、発現、分離、および精製段階を通して大きな問題を引き起こしました。包含体の形成とタンパク質の凝集は、タンパク質産生全体で重要なハードルでした。タンパク質の分離と精製のすべてのステップでの高濃度の変性剤の使用、および折り畳まれた機能性タンパク質を得るための温度依存性レネチング技術の使用を含む、これらの問題を解決した尺度について説明します。これらの困難にもかかわらず、私たちは最終的に、完全な精製手順の後、5〜10 mg/Lの活性、正しい折りたたみタンパク質のスープを回収しました。タンパク質の均一性は、クロマトグラフィー、電気泳動、および質量分析によって確立されました。さらに、循環二色性およびDNaseフットプリント分析による特性評価は、これらのアラニンベースの変異体がネイティブGCN4 DNA結合ドメインの構造と機能を保持していることを示しています。驚くべきことに、DNA結合基本領域に27の総アミノ酸の24のアラニンを含む最も重く変異したタンパク質は、ネイティブGCN4の標的であるAP-1部位にまだ結合しています。

GCN4 is a yeast transcriptional regulatory protein; its DNA-binding domain is a basic region/leucine zipper (bZIP) structure that comprises a dimer of alpha-helices capable of high-affinity, sequence-specific recognition of the DNA major groove. We are exploiting what nature has evolved by manipulating the bZIP motif as a molecular recognition scaffold; thus we reduced the elegantly minimal bZIP to an even more simplified structure by substitution with alanine residues-hence, a generic, Ala-based, helical scaffold. These Ala-based mutants are unusual proteins for expression as they are short ( approximately 100 amino acids) and hydrophobic (Ala-mutated basic regions, leucine-zipper dimerization domains). Hydrophobicity posed a major problem throughout the expression, isolation, and purification stages; inclusion body formation and protein aggregation were significant hurdles throughout protein production. We describe measures that solved these problems, including use of high concentrations of denaturant in all steps of protein isolation and purification and use of temperature-dependent renaturing techniques to obtain folded, functional protein. Despite these difficulties, we ultimately retrieved 5-10 mg/L of broth of active, correctly folded protein after the complete purification procedure. Homogeneity of the proteins was established by chromatography, electrophoresis, and mass spectrometry. Furthermore, characterization by circular dichroism and DNase footprinting analysis demonstrates that these alanine-based mutants retain the structure and function of the native GCN4 DNA-binding domain. Remarkably, the most heavily mutated protein, containing 24 alanines of 27 total amino acids in the DNA-binding basic region, still binds the AP-1 site, the target of native GCN4.