P-ヒドロキシベンゾ酸-3-ヒドロキシラーゼによる芳香族ヒドロキシル化のための量子機械的および分子機械的反応経路の計算

p-ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼ（PHBH）における活性C4a-ヒドロペルオキシフラビン補因子中間体によるp-ヒドロキシベンゾ酸の芳香族3-ヒドロキシル化の反応経路は、組み合わせた量子力的機械と分子機械的（QM/MM）方法によって調査されています。PHBH反応サイクルにおけるC4A-ヒドロペルオキシフラビン中間体の構造モデルは、酵素 - 堆積複合体の結晶構造座標に基づいて構築されました。その後のヒドロキシル化ステップの反応経路は、過酸化物の酸素酸素結合の切断と、基質のC3原子と過酸化物の遠位酸素間の炭素酸素結合の形成を含む反応座標を課すことにより計算されました。補因子。計算された反応経路に沿った幾何学的変化とムリケン電荷分布は、電気腺の芳香族置換タイプのメカニズムに沿っています。計算された反応のエネルギー障壁は、プロトン化ヒドロキシル部分で見つかった障壁と比較して、基質のヒドロキシル部分が脱プロトン化されると、かなり低くなります。計算されたエネルギーバリアに対する基質のプロトン化状態のこの効果は、基質のヒドロキシル化に脱プロトン化が必要であるという実験的観察をサポートします。計算された反応経路での顕著なイベントは、中間段階での過酸化物酸素酸素結合の延長です。反応経路のさらなる分析は、この酸素 - 酸素結合伸長が、過酸化物部分の遠位酸素に対する電気球反応性の増加を伴うことを示しています。。反応に対する個々の活性部位残基の効果の分析により、Pro293のバックボーンカルボニル部分による特定の遷移状態安定化が明らかになります。結晶水717は、水素結合の安定化ステップを駆動し、C4a-ヒドロペルオキシフラビン中間体の近位酸素へのハイドロキシル化ステップを駆動するように見えます。

The reaction pathway for the aromatic 3-hydroxylation of p-hydroxybenzoate by the reactive C4a-hydroperoxyflavin cofactor intermediate in p-hydroxybenzoate hydroxylase (PHBH) has been investigated by a combined quantum mechanical and molecular mechanical (QM/MM) method. A structural model for the C4a-hydroperoxyflavin intermediate in the PHBH reaction cycle was built on the basis of the crystal structure coordinates of the enzyme-substrate complex. A reaction pathway for the subsequent hydroxylation step was calculated by imposing a reaction coordinate that involves cleavage of the peroxide oxygen-oxygen bond and formation of the carbon-oxygen bond between the C3 atom of the substrate and the distal oxygen of the peroxide moiety of the cofactor. The geometric changes and the Mulliken charge distributions along the calculated reaction pathway are in line with an electrophilic aromatic substitution type of mechanism. The energy barrier of the calculated reaction is considerably lower when the substrate hydroxyl moiety is deprotonated, in comparison with the barrier found with a protonated hydroxyl moiety. This effect of the protonation state of the substrate on the calculated energy barrier supports experimental observations that deprotonation is required for hydroxylation of the substrate. A notable event in the calculated reaction pathway is a lengthening of the peroxide oxygen-oxygen bond at an intermediate stage. Further analysis of the reaction pathway indicates that this oxygen-oxygen bond elongation is accompanied by an increase in electrophilic reactivity on the distal oxygen of the peroxide moiety, which may assist the C-O bond formation in the reaction of the C4a-hydroperoxyflavin intermediate with the substrate. Analysis of the effect of individual active site residues on the reaction reveals a specific transition state stabilization by the backbone carbonyl moiety of Pro293. The crystal water 717 appears to drive the hydroxylation step through a stabilizing hydrogen bond interaction to the proximal oxygen of the C4a-hydroperoxyflavin intermediate, which increases in strength as the hydroperoxyflavin cofactor converts to the anionic (deprotonated) hydroxyflavin.