Sec18の支配的な陰性変異体のスクリーンは、ATP加水分解におけるAAAタンパク質コンセンサスシーケンスの役割を明らかにしています

進化的に古代のメカニズムは、酵母の小胞体網状体輸送からヒト脳のシナプス小胞エキソサイトーシスに至るまでの細胞内膜融合イベントに使用されます。このメカニズムの中心にあるのは、N-エチルメレイミド感受性融合タンパク質（NSF）、可溶性NSF付着タンパク質（SNAP）、およびSNAP受容体（SNARES）のコア複合体です。これらのタンパク質は小胞トラフィックの主要なプレーヤーとして受け入れられていますが、それらの分子作用メカニズムは不明のままです。NSFの重要な構造機能関係を照らすために、酵母NSF（SEC18P）の支配的な陰性変異体のスクリーンが実施されました。これには、GAL1調節SEC18酵母発現プラスミドのランダム変異誘発が含まれていました。ガラクトース誘導性成長停止に基づいて、いくつかの支配的な陰性対立遺伝子が特定され、そのうち1つは詳細に特徴付けられました。SEC18-109表現型（生合成経路を介した異常な膜の人身売買、膜管ネットワークの蓄積、成長抑制、細胞密度の増加）は、SEC18の単一のA-G置換によるものです。- > pro）。THR（394）はほとんどのAAAタンパク質で保存されており、実際、この大規模なタンパク質ファミリーの署名として機能する最小限のAAAコンセンサスシーケンスの一部を形成します。組換えSEC18-109pの分析は、突然変異がヘキサマージョン化または酵母アルファ-SNAP（SEC17P）との相互作用を防ぐことはないことを示していますが、代わりにSEC17Pで刺激できない検出不能なATPase活性をもたらします。これは、ATP加水分解の調節におけるAAAタンパク質コンセンサスシーケンスの役割を示唆しています。さらに、酵母における支配的な陰性変異体のスクリーニングのこのアプローチを他の保存されたタンパク質に適用して、哺乳類のカウンターパートの重要な機能的ドメインを強調することができます。

An evolutionarily ancient mechanism is used for intracellular membrane fusion events ranging from endoplasmic reticulum-Golgi traffic in yeast to synaptic vesicle exocytosis in the human brain. At the heart of this mechanism is the core complex of N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein (NSF), soluble NSF attachment proteins (SNAPs), and SNAP receptors (SNAREs). Although these proteins are accepted as key players in vesicular traffic, their molecular mechanisms of action remain unclear. To illuminate important structure-function relationships in NSF, a screen for dominant negative mutants of yeast NSF (Sec18p) was undertaken. This involved random mutagenesis of a GAL1-regulated SEC18 yeast expression plasmid. Several dominant negative alleles were identified on the basis of galactose-inducible growth arrest, of which one, sec18-109, was characterized in detail. The sec18-109 phenotype (abnormal membrane trafficking through the biosynthetic pathway, accumulation of a membranous tubular network, growth suppression, increased cell density) is due to a single A-G substitution in SEC18 resulting in a missense mutation in Sec18p (Thr(394)-->Pro). Thr(394) is conserved in most AAA proteins and indeed forms part of the minimal AAA consensus sequence that serves as a signature of this large protein family. Analysis of recombinant Sec18-109p indicates that the mutation does not prevent hexamerization or interaction with yeast alpha-SNAP (Sec17p), but instead results in undetectable ATPase activity that cannot be stimulated by Sec17p. This suggests a role for the AAA protein consensus sequence in regulating ATP hydrolysis. Furthermore, this approach of screening for dominant negative mutants in yeast can be applied to other conserved proteins so as to highlight important functional domains in their mammalian counterparts.