二量体のキネシンの微小管結合パターンの新しい外観

単量体および二量体のキネシンおよびNCDコンストラクトと微小管との相互作用は、クライオエレクトロン顕微鏡（CRYO-EM）およびいくつかの生化学的方法を使用して調査されています。チューブリンダイマーに結合した場合、二量体NCDの構造には、チューブリンに直接接続されている1つの頭を示し、2番目の頭が1つ目につながれた場合、良いコンセンサスがあります。ただし、二量体のキネシンモータードメインの3Dマップは依然として非常に議論の余地があり、異なる解釈の余地を残しています。ここでは、異なるヌクレオチド条件と異なる運動：チューブリン比の下での極低音域およびデジタル3D再構築による二量体のキネシンの微小管結合パターンを再投資し、茎によるモーターチューブリン複合体の分子量を測定しました。どちらの方法でも補完的な結果が明らかになりました。結合したキネシンモーターヘッドのアルファベタチューブリンダイマーの比率は、初期混合比に関係なく1.5を超えることは決してないことがわかりました。各キネシン二量体は、近くに無料のキネシンダイマーが2つの微小管結合部位を占有しているようです。したがって、さまざまな画像再構成の外観は、モーターヘッドの非特異的な過剰結合によって説明できます。その結果、X線構造を微小管の表面にドッキングするための異なる見かけの密度分布の使用は、異なる相互に排他的なモデルにつながります。化学量論的結合の条件では、キネシン二量体の2つの頭が分離し、異なるチューブリンサブユニットに結合することを提案します。これは、2つの頭が微小管の表面にしっかりと付着したままであるNCDとは対照的です。首のドメインに架橋された二量体のキネシン分子を使用して、二量体の2つのヘッドが2つのプロテフィラメントを架橋するのではなく、1つのプロトフィラメントに沿って結合することを強く兆候であることを強く兆候であることが軸方向にプロトフィラメントを安定させることがわかりました。これらの結果に基づいた分子ウォーキングモデルは、結論を要約し、そのようなモデルの対称性の意味を示しています。

The interactions of monomeric and dimeric kinesin and ncd constructs with microtubules have been investigated using cryo-electron microscopy (cryo-EM) and several biochemical methods. There is a good consensus on the structure of dimeric ncd when bound to a tubulin dimer showing one head attached directly to tubulin, and the second head tethered to the first. However, the 3D maps of dimeric kinesin motor domains are still quite controversial and leave room for different interpretations. Here we reinvestigated the microtubule binding patterns of dimeric kinesins by cryo-EM and digital 3D reconstruction under different nucleotide conditions and different motor:tubulin ratios, and determined the molecular mass of motor-tubulin complexes by STEM. Both methods revealed complementary results. We found that the ratio of bound kinesin motor-heads to alphabeta-tubulin dimers was never reaching above 1.5 irrespective of the initial mixing ratios. It appears that each kinesin dimer occupies two microtubule-binding sites, provided that there is a free one nearby. Thus the appearances of different image reconstructions can be explained by non-specific excess binding of motor heads. Consequently, the use of different apparent density distributions for docking the X-ray structures onto the microtubule surface leads to different and mutually exclusive models. We propose that in conditions of stoichiometric binding the two heads of a kinesin dimer separate and bind to different tubulin subunits. This is in contrast to ncd where the two heads remain tightly attached on the microtubule surface. Using dimeric kinesin molecules crosslinked in their neck domain we also found that they stabilize protofilaments axially, but not laterally, which is a strong indication that the two heads of the dimers bind along one protofilament, rather than laterally bridging two protofilaments. A molecular walking model based on these results summarizes our conclusions and illustrates the implications of symmetry for such models.