オステオポンチンのリン酸化は、血管平滑筋細胞の石灰化の阻害に必要です

オステオポンチン（OPN）は、骨組織における生体原性化に関連する非鎖骨性グリコシル化ホスホタン剤、ならびに異所性石灰化です。オステオポンチンはアテローム硬化性病変の石灰化沈着と共局在し、オステオポンチンが血管石灰化のヒト平滑筋細胞（HSMC）培養モデルにおけるカルシウム沈着を強力に阻害することを以前に報告しました。このレポートでは、オステオポンチンの鉱化阻害機能におけるリン酸化の役割を調べました。細菌由来の組換えOPNはHSMC鉱化を阻害しなかったため、OPNが石灰化を阻害する能力は、翻訳後の修飾に完全に依存していました。カゼインキナーゼII処理に続いて、リン酸化OPN（P-OPN）の用量依存的に阻害されたHSMCの石灰化は、in vitroで培養された石灰化を在来OPNと同じくらい効果的に阻害しました。オステオポンチンの阻害効果は、リン酸化の程度に依存していました。石灰化の阻害に重要なOPNの特定の構造ドメインを決定するために、OPNフラグメント（N末端、C末端、および全長）を比較し、リン酸化された断片と非リン酸化フラグメントの両方の阻害効果を比較しました。非リン酸化OPNフラグメントのいずれも石灰化に影響を与えませんでしたが、P-OPNはHSMC石灰化の線量依存性阻害を引き起こしました。P-OPNをアルカリホスファターゼで処理して、脱リン酸化OPNを作成しました。脱リン酸化OPNは、石灰化に阻害効果を持っていませんでした。HSMCによるOPN mRNAおよびP-OPN分泌の発現は、培養石灰化中に時間依存的に減少しました。これらの結果は、HSMCの石灰化に対するOPNの阻害効果にリン酸化が必要であり、OPNリン酸化の調節が細胞によって鉱化化が制御される1つの方法を表していることを示しています。

Osteopontin (OPN) is a non-collagenous, glycosylated phosphoprotein associated with biomineralization in osseous tissues, as well as ectopic calcification. We previously reported that osteopontin was co-localized with calcified deposits in atherosclerotic lesions, and that osteopontin potently inhibits calcium deposition in a human smooth muscle cell (HSMC) culture model of vascular calcification. In this report, the role of phosphorylation in osteopontin's mineralization inhibitory function was examined. The ability of OPN to inhibit calcification completely depended on post-translational modifications, since bacteria-derived recombinant OPN did not inhibit HSMC mineralization. Following casein kinase II treatment, phosphorylated OPN (P-OPN) dose-dependently inhibited calcification of HSMC cultured in vitro about as effectively as native OPN. The inhibitory effect of osteopontin depended on the extent of phosphorylation. To determine the specific structural domains of OPN important for inhibition of calcification, we compared OPN fragments (N-terminal, C-terminal, and full-length), and compared the inhibitory effect of both phosphorylated and non-phosphorylated fragments. While none of the non-phosphorylated OPN fragments effected calcification, P-OPN caused dose dependent inhibition of HSMC calcification. P-OPN was treated with alkaline phosphatase to create dephosphorylated OPN. Dephosphorylated OPN did not have an inhibitory effect on calcification. The expression of OPN mRNA and P-OPN secretion by HSMC were decreased in a time-dependent manner during culture calcification. These results indicate that phosphorylation is required for the inhibitory effect of OPN on HSMC calcification, and that regulation of OPN phosphorylation represents one way in which mineralization may be controlled by cells.