ガンマ - カルボキシグルタミル（GLA）残基に特異的なモノクローナル抗体を伴うビタミンK依存性タンパク質とペプチドの同定と精製

タンパク質およびペプチドのガンマ - カルボキシグルタミル（GLA）残基を特異的に認識する新しいモノクローナル抗体が産生されています。ウエスタンブロットと時間分解免疫蛍光アッセイによって実証されているように、抗体はテストされたGLA含有タンパク質のほとんどまたはすべてのPAN特異的です（因子、IX、およびX、プロトロンビン、プロテインC、タンパク質S、成長停止特異的タンパク質6、骨GLAタンパク質、コーンカタツムリのコナントキンG、および蛇毒のXA様タンパク質因子）。2鎖タンパク質のGLAを含む軽鎖のみが結合されました。脱炭酸は、プロトロンビンフラグメント1のエピトープを破壊し、Ca（2+）はプロトロンビンへの結合を強く阻害しました。ウエスタンブロット、免疫蛍光、および表面プラズモン共鳴アッセイでは、単一のGLAまたはタンデムペアのGLA残基のいずれかを含むウシ血清アルブミンに結合した抗体結合ペプチドを結合しました。GLA残基を取り囲む配列が変更されたときに、結合が維持されました。GLAにグルタミン酸を置き換えると、エピトープが完全に失われました。抗体の有用性は、GLA含有タンパク質を検出するための免疫化学的方法と、Tiger Snake毒のXA様タンパク質因子の免疫拡散で実証されました。GLAドメインのアミノ酸配列とヘビタンパク質の重鎖の部分を決定しました。

Novel monoclonal antibodies that specifically recognize gamma-carboxyglutamyl (Gla) residues in proteins and peptides have been produced. As demonstrated by Western blot and time-resolved immunofluorescence assays the antibodies are pan-specific for most or all of the Gla-containing proteins tested (factors VII, IX, and X, prothrombin, protein C, protein S, growth arrest-specific protein 6, bone Gla protein, conantokin G from a cone snail, and factor Xa-like proteins from snake venom). Only the Gla-containing light chain of the two-chain proteins was bound. Decarboxylation destroyed the epitope(s) on prothrombin fragment 1, and Ca(2+) strongly inhibited binding to prothrombin. In Western blot, immunofluorescence, and surface plasmon resonance assays the antibodies bound peptides conjugated to bovine serum albumin that contained either a single Gla or a tandem pair of Gla residues. Binding was maintained when the sequence surrounding the Gla residue(s) was altered. Replacement of Gla with glutamic acid resulted in a complete loss of the epitope. The utility of the antibodies was demonstrated in immunochemical methods for detecting Gla-containing proteins and in the immunopurification of a factor Xa-like protein from tiger snake venom. The amino acid sequences of the Gla domain and portions of the heavy chain of the snake protein were determined.