Na、K-ATPaseベータ1の低外部カリウムによる低外部カリウムによるSP1およびSP3の役割によるサブユニット遺伝子転写の調節

Na、K-ATPase活性の発現は、低外部K（+）の存在下で拡張間隔のためにインキュベートされた細胞でアップレギュレートされます。私たちの以前のデータは、低k（+）への心筋細胞の曝露がNa、K-ATPase Beta1サブユニットmRNAの定常状態の存在量を増加させることを示しました。本研究では、転写レベルで低いK（+）拡張NA、K-ATPase Beta1遺伝子発現を伴う新生児ラット心筋細胞の初代培養のインキュベーションと、この効果が細胞外Ca（2+）を必要とすることを決定しました。Na、K-ATPase Beta1遺伝子転写に対する低K（+）の刺激効果は、心筋細胞の収縮活性の増加に依存していませんでした。Na、K -ATPase Beta1 5' -Flanking領域欠失プラスミドは、一過性トランスフェクション分析で使用され、ヌクレオチド-62から-42の間の領域が低いK（+）応答要素を含んでいることが示されました。Beta1プロモーターの-58/-56領域における潜在的なGCボックスコアモチーフGCGの部位指向変異誘発により、基底および低K（+）媒介転写が減少しました。ヌクレオチド-101と-99の間に位置する推定GCボックス要素のコア配列の変異は、Beta1遺伝子転写に対する低いK（+）効果をさらに減少させました。Beta1プロモーターの近位および遠位GCボックス要素にまたがるオリゴヌクレオチドを使用した電気泳動移動度シフトアッセイは、低K（+）に応答して2つの複合体の結合の強化を示しました。ゲルシフト分析の競合他社としてコンセンサスGCボックスシーケンスを含めると、低k（+）応答要素への因子結合が減少しました。転写因子SP1およびSP3に対する抗体は、DNA結合複合体の両方の成分と相互作用し、GCボックス変異体を使用したゲルシフト研究では除外されました。これらのデータは、これらのデータが、ラットNAの2つのGCボックス要素にSP1とSP3の結合を強化することを示しています。K-ATPase Beta1サブユニット遺伝子プロモーターは、低外部K（+）に曝露した新生児ラット心筋細胞のBeta1遺伝子転写のアップレギュレーションを媒介します。

Expression of Na,K-ATPase activity is up-regulated in cells incubated for extended intervals in the presence of low external K(+). Our previous data showed that exposure of cardiac myocytes to low K(+) increased the steady-state abundance of Na,K-ATPase beta1 subunit mRNA. In the present study we determined that incubation of primary cultures of neonatal rat cardiac myocytes with low K(+) augmented Na,K-ATPase beta1 gene expression at a transcriptional level and that this effect required extracellular Ca(2+). The stimulatory effect of low K(+) on Na,K-ATPase beta1 gene transcription was not dependent on increased contractile activity of cardiac myocytes. Na,K-ATPase beta1 5'-flanking region deletion plasmids used in transient transfection analysis demonstrated that the region between nucleotides -62 to -42 of the beta1 promoter contained a low K(+) response element. Site-directed mutagenesis of a potential GC box core motif GCG in the -58/-56 region of the beta1 promoter decreased basal and low K(+)-mediated transcription. Mutation of the core sequence of a putative GC box element located between nucleotides -101 and -99 further decreased the low K(+) effect on beta1 gene transcription. Electrophoretic mobility shift assays using oligonucleotides spanning the proximal and distal GC box elements of the beta1 promoter showed enhanced binding of two complexes in response to low K(+). The inclusion of a consensus GC box sequence as a competitor in gel shift analysis reduced factor binding to the low K(+) response elements. Antibodies to transcription factors Sp1 and Sp3 interacted with components of both DNA-binding complexes and binding of nuclear factors was abolished in gel shift studies using GC box mutants. Together these data indicate that enhanced binding of Sp1 and Sp3 to two GC box elements in the rat Na,K-ATPase beta1 subunit gene promoter mediates beta1 gene transcription up-regulation in neonatal rat cardiac myocytes exposed to low external K(+).