緑色蛍光タンパク質/FLPリコンビナーゼ融合タンパク質とフローサイトメトリーソートの使用

FLPリコンビナーゼは、FRTサイトとして指定された特定の配列での真核DNAのin vivo操作に広く使用されています。再結合が発生した細胞の薬剤耐性や代謝選択を必要とせずにFLPを介した組換えを使用する方法を開発しました。FLPリコンビナーゼと緑色蛍光タンパク質（GFP）コード配列からなる融合タンパク質の発現を指示する発現プラスミドを生成しました。FLPリコンビナーゼ基質を含むK562細胞にプラスミドを導入し、フローサイトメトリックソートによりトランスフェクトされた細胞を選択した場合、GFP陽性細胞は、未留め細胞と比較してFLPを介した再結合イベントに対して5〜30倍濃縮されました。これらの研究は、薬剤耐性または代謝マーカー遺伝子を必要とせずにin vivoで染色体DNAを操作するためのGFP/FLPリコンビナーゼ融合タンパク質の有用性を示しています。

Flp recombinase has been used extensively for in vivo manipulation of eukaryotic DNA at specific sequences designated as FRT sites. We developed a method to use Flp-mediated recombination without the need for drug resistance or metabolic selection of cells in which recombination has occurred. We generated expression plasmids directing expression of fusion proteins consisting of Flp recombinase and green fluorescent protein (GFP) coding sequences. When the plasmids were introduced into K562 cells containing Flp recombinase substrates and transfected cells were selected for by flow cytometric sorting, GFP-positive cells were enriched 5- to 30-fold for Flp-mediated recombination events compared with unsorted cells. These studies demonstrate the usefulness of GFP/Flp recombinase fusion proteins to manipulate chromosomal DNA in vivo without requiring drug resistance or metabolic marker genes.