洗浄によるCD34（+）造血前駆細胞の喪失は、固定液のない赤血球溶解試薬を使用することにより減少する可能性があります

CD34（+）造血前駆細胞（HPC）のフローサイトメトリック排出前のサンプル調製のための現在のプロトコルには、lyse-non-washおよびlyseおよび洗浄方法の両方が含まれます。洗浄なしの赤血球溶解は、絶対細胞数を評価する場合に選択する方法ですが、バックグラウンド蛍光を減らすためにCD34（+）細胞の免疫学的サブタイピングには洗浄ステップが推奨されます。ここでは、赤血球溶解試薬の種類と（I）CD34（+）細胞列挙の結果と（II）CD34（+）細胞によるCD34（+）細胞の結果に対する洗浄との間の相互作用の効果を分析しました。- ブラッド染色アッセイ[Gratama、J.W.、Keeney、M.、Sutherland、D.R.、1999。CD34（+）造血幹細胞および前駆細胞の列挙。Curr。Protocols Cytometry 6（4）、1-22。]。臍帯血（n = 4）、動員末梢血（n = 4）および格差生成物（n = 4）からの12のサンプルを使用して、7つの市販の溶解試薬（5つの固定液と2つの固定液を含まない固定液を含む）を研究しました。Lyseおよび洗浄技術を使用して、CD34（+）細胞の絶対数と相対数の有意な減少、ならびにリンパ球と白血球の数が、LYSEと比較して固定含有バッファーを使用して溶解したサンプルで観察されました。- ノーウォッシュテクニック。洗浄による細胞損失は、固定液のないバッファーを使用してサンプルを溶解した場合、大幅に減少する可能性があります。PBS+1％パラホルムアルデヒドを使用して、固定液のないバッファーを使用して溶解し、洗浄したサンプルのパラホルムアルデヒドを使用しても、CD34（+）細胞または他の細胞タイプの追加損失は発生しませんでした。最後に、固定されていないサンプルを洗浄すると、赤血球溶解中に固定されたサンプルと比較して、CD34（+）細胞に結合したCD38モノクローナル抗体がわずかに減少しました。これらの結果は、固定レンダリング（CD34（+））細胞が粘着性があり、遠心分離と再懸濁時に細胞懸濁液からの損失につながることを示しています。7つの溶解試薬はすべて、lyse-no-wash技術に自信を持って使用できると結論付けますが、洗浄ステップが必要であると考えられる場合は、洗練されていない溶解試薬のみを使用する必要があります。

Current protocols for sample preparation before flow cytometric enumeration of CD34(+) hematopoietic progenitor cells (HPC) include both lyse-non-wash and lyse and wash methods. Erythrocyte lysis without washing is the method of choice when absolute cell counts are to be assessed, whilst a washing step is recommended for immunological subtyping of CD34(+) cells in order to reduce background fluorescence. Here, we analyzed the effect of the interaction between type of erythrocyte lysis reagent and washing on the outcomes of (i) CD34(+) cell enumeration and (ii) expression of CD38 by CD34(+) cells in a single-platform, whole-blood staining assay [Gratama, J.W., Keeney, M., Sutherland, D.R., 1999. Enumeration of CD34(+) hematopoietic stem cell and progenitor cells. Curr. Protocols Cytometry 6(4), 1-22.]. We studied seven commercially available lysing reagents (five containing fixative and two fixative-free) using 12 samples from cord blood (n=4), mobilized peripheral blood (n=4) and apheresis products (n=4). Using the lyse and wash technique, significant reductions of absolute and relative numbers of CD34(+) cells, as well as in the numbers of lymphocytes and leukocytes, were observed on samples that had been lysed using fixative-containing buffers as compared to the lyse-no-wash technique. Cell losses due to washing could be significantly reduced when samples were lysed using fixative-free buffers. 'Postfixation' using PBS+1% paraformaldehyde of samples that had been lysed using fixative-free buffers and then washed did not result in additional loss of CD34(+) cells or other cell types. Finally, washing unfixed samples led to a slight decrease of CD38 monoclonal antibody bound to CD34(+) cells as compared to samples that had been fixed during erythrocyte lysis. These results indicate that fixation renders (CD34(+)) cells sticky and leads to their loss from the cell suspension upon centrifugation and resuspension. We conclude that all seven lysing reagents can be used with confidence in a lyse-no-wash technique, but that only fixative-free lysing reagents should be used when a washing step is considered necessary.