PCR産物を使用して、大腸菌K-12における染色体遺伝子のワンステップ不活性化

PCRプライマーが標的遺伝子と相同性を提供する大腸菌の染色体遺伝子を破壊するためのシンプルで非常に効率的な方法を開発しました。この手順では、組換えにはファージラムダ赤リコンビナーゼが必要です。これは、簡単に治癒できるコピー数プラスミドの誘導性プロモーターの制御下で合成されます。このアプローチの有用性を実証するために、不活性化する遺伝子に隣接する領域に相応した36〜50 ntの拡張を備えたプライマーを使用してPCR産物を生成し、FRP認識によって隣接する抗生物質耐性遺伝子を運ぶテンプレートプラスミドターゲット）サイト。それぞれのPCR産物を使用することにより、染色体遺伝子の13の異なる破壊を行いました。ARCB、CYAA、LACZYA、OMPR-ENVZ、PHNR、PSTB、PSTCA、PSTS、PSTSCAB-PHOU、RECA、およびOperonの変異体は、赤い発現プラスミドを導入した後、抗生物質耐性コロニーとして抗生物質耐性コロニーとして分離されました。合成（PCR生成）DNA。次に、耐性遺伝子を、簡単に治癒できるFLPリコンビナーゼをコードするヘルパープラスミドを使用して除去されました。この手順は、野生型細胞で行うことができるため、特に大腸菌およびその他の細菌のゲノム分析において、広く有用である必要があります。

We have developed a simple and highly efficient method to disrupt chromosomal genes in Escherichia coli in which PCR primers provide the homology to the targeted gene(s). In this procedure, recombination requires the phage lambda Red recombinase, which is synthesized under the control of an inducible promoter on an easily curable, low copy number plasmid. To demonstrate the utility of this approach, we generated PCR products by using primers with 36- to 50-nt extensions that are homologous to regions adjacent to the gene to be inactivated and template plasmids carrying antibiotic resistance genes that are flanked by FRT (FLP recognition target) sites. By using the respective PCR products, we made 13 different disruptions of chromosomal genes. Mutants of the arcB, cyaA, lacZYA, ompR-envZ, phnR, pstB, pstCA, pstS, pstSCAB-phoU, recA, and torSTRCAD genes or operons were isolated as antibiotic-resistant colonies after the introduction into bacteria carrying a Red expression plasmid of synthetic (PCR-generated) DNA. The resistance genes were then eliminated by using a helper plasmid encoding the FLP recombinase which is also easily curable. This procedure should be widely useful, especially in genome analysis of E. coli and other bacteria because the procedure can be done in wild-type cells.