ヒト内皮細胞ECTO-ADPASE/可溶性CD39の部位指向変異誘発：酵素活性と血小板動員の阻害のためのグルタミン酸174およびセリン218の要件

内皮細胞CD39/ecto-Adpaseは、血管恒常性に大きな役割を果たします。刺激された血小板から放出されたADPを急速に代謝し、それにより、さらに血小板の活性化と動員を防ぎます。最近、CD39と同一の酵素的および生物学的特性を備えた、ヒトCD39の組換え、可溶性型SolCD39を開発しました。酵素/生物学的活性に不可欠なアミノ酸を特定するために、SOLCD39の4つの高度に保存されたアピラーゼ領域内で部位指向の突然変異誘発を実施しました。グルタミン酸174のアラニン（E174A）およびセリン218からアラニン（S218A）への突然変異により、それぞれSOLCD39酵素活性が約90％減少しました。さらに、野生型と比較して、S57AはATPase活性の変化なしにADPase活性の2倍の増加を示し、一方、チロシン127からアラニン（Y127A）変異体は、ADPaseおよびATPase活性の両方の50-60％を失いました。野生型solCD39および各変異体のアドペース活性は、R135aを除く、マグネシウムよりも必要な二重陽イオンとしてカルシウムで大きかったが、ATPase活性については一般にそのような好みは観察されなかった。Y127Aは、酵素活性が大幅に減少したにもかかわらず、野生型のそれよりも2.8倍高いカルシウム/マグネシウムアドパーゼ活性比を実証しました。solCD39変異体は、酵素をin vitro血小板凝集システムにおける生物活性と相関させることによってさらに特徴付けられました。各SOLCD39変異体は、E174AおよびS218Aを除き、血小板凝集の逆転において野生型に類似していた。E174Aは、酵素活性を完全に欠いており、予想されるように血小板の応答性を阻害できませんでした。ADPase活性が91％減少したS218Aは、野生型SOLCD39よりもはるかに効果的ではあるが、血小板凝集を逆転させる可能性があります。したがって、グルタミン酸174およびセリン218は、solCD39の酵素的および生物学的活性の両方に不可欠です。

Endothelial cell CD39/ecto-ADPase plays a major role in vascular homeostasis. It rapidly metabolizes ADP released from stimulated platelets, thereby preventing further platelet activation and recruitment. We recently developed a recombinant, soluble form of human CD39, solCD39, with enzymatic and biological properties identical to CD39. To identify amino acids essential for enzymatic/biological activity, we performed site-directed mutagenesis within the four highly conserved apyrase regions of solCD39. Mutation of glutamate 174 to alanine (E174A) and serine 218 to alanine (S218A) resulted in complete and approximately 90% loss of solCD39 enzymatic activity, respectively. Furthermore, compared to wild-type, S57A exhibited a 2-fold increase in ADPase activity without change in ATPase activity, while the tyrosine 127 to alanine (Y127A) mutant lost 50-60% of both ADPase and ATPase activity. The ADPase activity of wild-type solCD39 and each mutant, except for R135A, was greater with calcium as the required divalent cation than with magnesium, but for ATPase activity generally no such preference was observed. Y127A demonstrated the highest calcium/magnesium ADPase activity ratio, 2.8-fold higher than that of wild-type, even though its enzyme activity was greatly reduced. SolCD39 mutants were further characterized by correlating enzymatic with biological activity in an in vitro platelet aggregation system. Each solCD39 mutant was similar to wild-type in reversing platelet aggregation, except for E174A and S218A. E174A, completely devoid of enzymatic activity, failed to inhibit platelet responsiveness, as anticipated. S218A, with 91% loss of ADPase activity, could still reverse platelet aggregation, albeit much less effectively than wild-type solCD39. Thus, glutamate 174 and serine 218 are essential for both the enzymatic and biological activity of solCD39.