INCBプラスミドの複製イニシエータータンパク質トランスの活性に対するCIの効果

INCBプラスミドPMU720の複製イニシエータータンパク質であるRepaは、CISで優先的に作用します。REPAのCIS活性は、RepAのコーディング領域をPMU720の原点（ORI）から分離するDNAの166 bp領域であるCISによって媒介されると考えられています。Repaのトランス活性を調査するために、同族のORIを使用せずに、Repa遺伝子をマルチコピープラスミドPSU39にクローニングしました。Repaが作動するORIは、イソプロピルベータ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）による誘導なしにレプリコンが不活性であるプラスミドであるPAM34にクローニングされました。したがって、IPTGが存在しない場合、PAM34誘導体の複製は、PSU39誘導体からトランスで生成されたREPAによるクローンORIの活性化に依存していました。in vivoでのオリプラスミドの複製の効率に対するレパ産生またはオリプラスミド、またはその両方に存在する場合、CIの効果が決定されました。Repaを生成するプラスミドでのCISの存在は、オリプラスミドの複製の効率を低下させました。CISのこの阻害活性は配列特異的であり、C末端20〜37アミノ酸との相互作用が関係していました。対照的に、cisはオリプラスミドに存在するときに効果がありませんでした。トランスのORIからの複製の開始は、CIへの転写とは無関係でした。

RepA, the replication initiator protein of the IncB plasmid pMU720, acts preferentially in cis. The cis activity of RepA is thought to be mediated by CIS, a 166-bp region of DNA separating the coding region of repA from the origin of replication (ori) of pMU720. To investigate the trans activity of RepA, the repA gene, without its cognate ori, was cloned on a multicopy plasmid, pSU39. The ori on which RepA acts was cloned on pAM34, a plasmid whose replicon is inactive without induction by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Thus, in the absence of IPTG, replication of the pAM34 derivatives was dependent on activation of the cloned ori by RepA produced in trans from the pSU39 derivatives. The effect of CIS, when present either on the RepA-producing or the ori plasmid or both, on the efficiency of replication of the ori plasmid in vivo, was determined. The presence of CIS, in its native position and orientation, on the RepA-producing plasmid reduced the efficiency of replication of the ori plasmid. This inhibitory activity of CIS was sequence specific and involved interaction with the C-terminal 20 to 37 amino acids of RepA. By contrast, CIS had no effect when present on the ori plasmid. Initiation of replication from the ori in trans was independent of transcription into CIS.