ショウジョウバエS2細胞で発現するヒスチジンタグ付き組換えタンパク質の精製のための修飾された金属アフィニティクロマトグラフィー手順

遊離銅イオンを含む条件付き培地からのヒスチジンタグ付きタンパク質の精製に使用できる、固定化された金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（IMAC）の修正方法を開発しました。Ni-NTAなどの樹脂を使用したIMAC精製の古典的な方法は、このタイプの精製に対して非効率的であることが証明されており、帯電した樹脂へのHisタグ付きタンパク質の結合との分離的な銅イオンの干渉により、複数のステップが必要であることが証明されています。対照的に、Ni-NTAの代わりにキレートセファロースを使用したこの修正IMAC手順により、銅含有培地からの効率的な精製が単一のステップで効率的に精製されます。この方法は、タンパク質銅複合体と固定化されたキレート樹脂の優先的な相互作用に依存しているようです。この方法を利用して、再結合P40とHisタグ付きP35サブユニットを共発現するショウジョウバエS2細胞の条件付き媒体からの活性なヒツジマウスインターロイキン12を精製し、エリソロポエチン受容体の細胞外ドメインの精製のために精製しました。この方法は、ショウジョウバエ細胞および遊離金属イオンが存在する他のシステムで発現する多種多様なHisタグ付き融合タンパク質の精製に適用できるはずです。

We have developed a modified method of immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC) that can be used for the purification of histidine-tagged proteins from conditioned medium containing free copper ions. Classical methods of IMAC purification, using resins such as Ni-NTA, have proven inefficient for this type of purification and require multiple steps due to the interference of divalent copper ions with the binding of His-tagged protein to the charged resin. In contrast, this modified IMAC procedure, using chelating Sepharose instead of Ni-NTA, enables efficient purification from copper-containing medium in a single step. This method appears to rely upon a preferential interaction of protein-copper complexes with immobilized chelating resin. We have utilized this method to purify active, His-tagged murine interleukin 12 from the conditioned medium of Drosophila S2 cells coexpressing recombinant p40 and His-tagged p35 subunits and for the purification of the extracellular domain of the erythropoietin receptor. This method should be applicable to the purification of a wide variety of His-tagged fusion proteins expressed in Drosophila cells and in other systems where free metal ions are present.